ف اسپرم……………………………………………………………………………………………64
1-1-3) نتايج حاصل از شمارش اسپرم در اپي ديديم………………………………………………………………………………….64
2-1-3) نتايج حاصل از مطالعه ميزان اسپرم زنده………………………………………………………………………………………..65
3-1-3) نتايج حاصل از شمارش اسپرم هاي نابالغ………………………………………………………………………………………66
4-1-3) نتايج حاصل از مطالعه کروماتين اسپرم………………………………………………………………………………………….67
2-3) نتايج حاصل از مطالعه پارامترهاي مختلف لقاح (IVF)………………………………………………………………………70
1-2-3) نتايج حاصل از تعداد اووسيت هاي لقاح يافته در گروه هاي مختلف آزمايش…………………………………….70
2-2-3) نتايج حاصل از تعداد جنين هاي دو سلولي…………………………………………………………………………………….71
3-2-3) نتايج حاصل از تعداد بلاستوسيست……………………………………………………………………………………………….72
4-2-3)نتايج حاصل از تعداد جنين هاي ارست شده…………………………………………………………………………………….73
5-2-3) نتايج حاصل از تعداد جنين هاي تيپ 1………………………………………………………………………………………… 74
6-2-3)نتايج حاصل از جنين هاي تيپ 2……………………………………………………………………………………………………75
6-2-3) تنايج حاصل از تعداد جنين هاي تيپ 3………………………………………………………………………………………….76
4-3)نتايج بخش هيستوشيميايي………………………………………………………………………………………………………………….80
1-4-3) نتايج مربوط به رنگ آميزي PAS ……………………………………………………………………………………………….. 81
2-4-3)نتايج مربوط به رنگ آميزي Sudan Black …………………………………………………………………………………..82
3-4-3) بررسي آلکالين فسفاتاز بافتي……………………………………………………………………………………………………………83
5-3) نتايج حاصل از هيستومورفومتري بيضه………………………………………………………………………………………………….84
1-5-3)نتايج حاصل از اندازه گيري قطرلوله هاي سمينيفر و ضخامت اپي تليوم لوله هاي ………………………………….84
2-5-3) نتايج حاصل از اندازه گيري تعداد سلول هاي ليديگ بيضه………………………………………………………..86
3-5-3) نتايج حاصل از اندازه گيري تعداد سلولهاي لنفاوي تک هستهاي………………………………………………87
6-3) نتايج حاصل ازاندازه گيري ارزيابيهاي اسپرماتوژنز……………………………………………………………………..87
1-6-3) نتايج حاصل ازاندازه گيري ضريب ميوزي و ضريب بازسازي ……………………………………………………88
2-6-3) نتايج حاصل از اندازه گيري ضريب تمايز لولهاي………………………………………………………………………89
3-6-3) نتايج حاصل از اندازه گيري ضريب سلول سرتولي…………………………………………………………………..90
فصل چهارم : بحث ونتيجه گيري
بحث ونتيجه گيري …………………………………………………………………………………………………………………………..92
پيشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………….102
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..103
چکيده
سيکلوسپورين A از يک مولکول پپيد حلقوي خنثي داراي يازده اسيد آمينه باوزن مولکولي 1201دالتون با خاصيت هيدروفوبي تشکيل شده است که به عنوان يک عامل سرکوب کننده سيستم ايمني در پيوند عضو مورد استفاده قرار مي گيرد. عصاره آبي زالزالک و هسته انگور از گياهان دارويي مي باشند که به سبب دارا بودن ويژگي هاي دارويي متعدد از جمله خواص آنتي اکسيدانتي مورد توجه بسيار قرار گرفته اند.اين مطالعه به منظور ارزيابي کارايي عصاره آبي زالزالک و هسته انگورکه داراي فعاليت آنتي اکسيدانتي مي باشند، به عنوان ترکيبات محافظ در برابر مسموميت بيضه ناشي از داروي سيکلوسپورين آ بر روي سيستم توليد مثلي رت نر صورت پذيرفت. براي انجام اين اين مطالعه تعداد 32 رت نر نژاد ويستار با ميانگين وزني 20± 200 گرم متعاقب يک هفته سازگاري با شرايط محيطي جديد به صورت تصادفي به چهار گروه تقسيم شدند (کنترل، سيکلوسپورينآ، سيکلوسپورين و عصاره آبي زالزالک، سيکلوسپورين و عصاره آبي هسته انگور). سه گروه از موش ها داروي سيکلوسپورين را با دوز mg/kg/day40 به صورت محلول در نيم ميلي ليتر روغن کنجد روزانه دريافت مينمود. دو گروه از گروههاي فوق عصاره آبي زالزالک و روغن هسته انگور را با دوز mg/kg/day150دريافت کردند. بعد از روزهاي 25 و 45 در تمام گروهها رت ها آسانکشي و کالبد گشايي شدند ، بيضه ها واپي ديديم ها جداسازي شدند. به دنبال ارزيابي خصوصيات اسپرم، ميزان باروري آزمايشگاهي(IVF) ، تغييرات مورفولوژيک و مورفومتريک، شاخص اسپرماتوژنز، ميزان کربوهيدرات ها و چربي ها و نيز فعاليت آنزيم آلکالين فسفاتاز مورد ارزيابي قرار گرفت. گروهي از رت ها که داروي سيکلوسپورينآ را دريافت کرده بودند (بمدت 25 و 45 روز) کاهش معني داري (P<0.05) در شاخص هاي اسپرماتوژنز (ضريب سلول سرتولي و ضريب ميوزي)، پارامترهاي استريولوژيک (قطر و ارتفاع اپي تليوم، تعداد سلول هاي ليديگ) به همراه تغييرات مورفولوژيک در بافت بيضه شامل آتروفي لوله هاي مني ساز، کاهش تعداد سلول هاي زايا، افزايش تعداد ماست سل هاو افزايش فضاي بينابيني در بافت همبند بينابيني را نشان دادند. سلول هاي اسپرماتوژنيک در موشهاي تحت درمان با سيکلوسپورين آ واکنش ضعيفي نسبت به رنگ آميزي PAS، واکنش بالايي نسبت به رنگ آميزي با سودان بلک و آلکالين فسفاتاز نشان دادند. علاوه بر اين تجويز داروي سيکلوسپورين کاهش معنيدار درتعداد اسپرم ها (P<0.05) و افزايش معنيدار اسپرم هاي مرده و غيرطبيعي و اسپرم هاي با کروماتين آسيب ديده را موجب گرديد. حال آنکه درمان همزمان با عصاره آبي گياه زالزالک و هسته انگور بهبود قابل ملاحظه اي را در پارامترهاي مذکور سبب گرديد. يافته هاي بدست آمده از اين مطالعه نشان مي دهد که داروي سيکلوسپورين آ به واسطه اعمال استرس اکسيداتيو مي تواند موجبات آسيب بافت بيضه را فراهم آورد، درحالي که عصاره ابي گياه زالزالک و روغن هسته انگور به سبب دارا بودن قابليت مهار راديکال هاي آزاد و فرآيند هاي اکسيداتيو مي توانند به گونه اي موثر در برابر واکنش هاي ناخواسته ناشي از اين دارو نقش ايفا کند. آنها همچنين باعث بهبود روند رشد جنيني، کيفيت جنين ها و سبب افزايش درصد اووسيت هاي لقاح يافته، جنين هاي دو سلولي، بلاستوسيستها و کاهش توقف جنيني و افزايش ميزان شکافتگي و بهبود مورفولوژي جنين هاي کشت داده شده گرديد (P<0.05).
کلمات کليدي: رت، سيستم توليد مثلي، سيکلوسپورين، عصاره زالزالک، عصاره هسته انگور
فصل اول
مقدمه وهدف
1-1) ناباروري
ناباروري مشکلي است که هماکنون بسياري از زوجها را درگير ميکند و موجب از هم پاشيدگي بسياري از خانوادهها ميشود و به عنوان يک بحران رواني، استرس زيادي را بر زوجهاي نابارور وارد نموده و به طرق گوناگون سلامت رواني آنها را تهديد ميکند.Freeman et al., 1985)). در ?? درصد موارد ناباروري مردان، عدم وجود اسپرم در مايع انزال علت اصلي ناباروري ميباشد (Matzuk and Lamb, 2007) .
اولين گام جهت بررسي و ارزيابي باروري و يا ميزان سلامت توليدمثلي مردان، تخمين پارامترهاي اسپرمي توسط آناليز مايع مني ميباشد. آناليز اسپرم شامل محاسبه تراکم، درصد تحرک و بررسي مورفولوژي اسپرم ميباشد. حداقل ميزان اين پارامترها در باروريهاي طبيعي، از طريق بررسي پارامترهاي اسپرمي در زوجهاي بارور، توسط سازمان بهداشت جهاني به صورت دورهاي اعلام ميشود. با توجه به اينکه مقادير طبيعي اعلام شده توسط سازمان بهداشت جهاني از طريق بررسي جمعيتهاي بارور تعيين ميشود، در مواردي که پارامترهاي اسپرمي در دامنه مقادير طبيعي قرار نگيرند، فرد نابارور محسوب ميشود و متعاقب آن مشکلات اجتماعي و فشارهاي روحي بسياري براي زوجين بوجود ميآيد.
استفاده از برخي داروها در درمان بيماريها باعث اختلال توليد اسپرم و در نهايت منجر به عقيمي در مردان ميشود (Dollery, 1999). پيدايش تکنيک جراحي پيوند اعضاء در پزشکي دريچه وسيعي براي نجات بعضي بيماران گشوده است که بدون شک افزايش طول عمر، بقا و سلامت اين بيماران بعداز عمل پيوند متضمن استفاده از داروهاي مهارکننده سيستم ايمني1 مي باشد. امروزه مشکل اساسي در پيوند اعضا پيچيدگي محافظت سيستم ايمني گيرنده عضو در مقابل واکنشهاي ايمني – تخريبي عضو بيگانه در بدن ميباشد. در حال حاضر عوامل و داروهاي سرکوبگر مختلفي نظيرکورتيکواستروئيدها، سيکلوسپورين، ميکوفنولات موفتيل و اسپراگولين و يا عوامل سيتوتوکسيک نظير آزاتيوپرين، سيکلوفسفاميد حتي آنتي بادي ايمونوساپرسيو به منظور سرکوب سيستم دفاعي بدن گيرنده عضو مورد استفاده قرار ميگيرند. از ميان داروهاي ذکر شده سيكلوسپورين از داروهاي ايمونوساپرسور اصلي است كه در بيماران پيوند كليه استفاده ميشود.
سيكلوسپورين آ با افزايش سطح ترومبوكسانB2 ، فعاليت سيتوكرومP- 450 ، مالونيل دي آلدئيد، لاكتات دهيدروژناز، گليكوليك اكسيداز ، گزانتين اكسيداز و به دنبال آن توليد انواع راديكالهاي آزاد باعث ايجاد حالت نفروتوكسي و هپاتوتوكسي و غيره ميشود. اين اختلالات ممكن است به طور ثانوي منجر به تغييرات تخريبي و اختلال عمل كرد بيضه شوند (Adhirai and Selvam, 1998; Durak et al., 1998 ). عصارههاي حاصل از قسمتهاي مختلف گياه زالزالک داراي اثرات آنتياکسيداني بوده و قادر به مهار آنيون سوپراکسيد، راديکال هيدروکسيل، پراکسيدهاي هيدروژن و نيز پراکسيداسيون ليپيدي ميباشند (Bahorun et al., 1996). فعاليتهاي آنتي اکسيداني و مهار راديکال هاي آزاد نتيجه عملکرد ترکيبات فنلي و فلاونوئيدهاي موجود در اين گياه ميباشد (Zhang et al., 2001). عصاره هسته انگور داراي خاصيت آنتي اکسيدانتي و مهار فعاليت راديکال هاي آزاد مي باشد (Jayaprakasha et al., 2003). بسياري از اثرات بهداشتي مفيد عصاره هسته انگور به مهار خواص آنتي اکسيداني و راديکال هاي آزاد نسبت داده شده است (Faria et al., 2006). به دليل اينکه عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور داراي خواص آنتياکسيدانتي بوده و باعث مهار راديکالهاي آزاد و کم کردن تخريب سلولي ميشوند در اين تحقيق از آنها استفاده شده است.
هدف از اين مطالعه بررسي اثر عصاره هسته انگور سياه و عصاره زالزالک بر روي تغييرات هيستوشيمي بيضه وتوان باروري (IVF) رتهاي نر (Rat) تيمار شده با داروي سيکلوسپورين است.
کليات
2-1)دستگاه توليد مثل نر در پستانداران
دستگاه توليد مثلي در جنس نر از بيضهها، مجاري تناسلي، غدد ضميمه و آلت تناسلي تشکيل شده است. اين دستگاه ارتباط نزديکي با سيستم ادراري داشته و اغلب تحت عنوان دستگاه اوروژنيتال معروف است.
بيضهها در مرحله جنيني در پشت پرده صفاق و مجاور ديواره خلفي حفره شکم تکامل مييابند (رجحان، 1367)، سپس به طرف اسکروتوم که در انتهاي طنابهاي اسپرماتيک قرار گرفته، مهاجرت کرده و درون آن آويزان ميشوند. در هنگام مهاجرت به اسکروتوم، هر بيضه با خود کيسه اي سروزي به نام تونيکا واژناليس را حمل مي کند که از صفاق منشأ مي گيرد. اين پوشش داراي يک لايه جداري خارجي و يک لايه احشايي داخلي است که در قسمت هاي جلويي و طرفيني بيضه، سفيدپرده را پوشانده است(Junqueira, 2005). فضايي که بين لايه جداري و لايه احشايي تونيکا واژيناليس وجود دارد تحت عنوان فضاي واژينال ناميده ميشود (Eurell, 2006). سفيد پرده در سطح خلفي بيضه ضخيم شده و مدياستينوم بيضه يا تيغه مياني بيضه را تشکيل ميدهد که از اين قسمت ديوارهاي فيبري به درون بيضه نفوذ کرده و آنرا به 250 بخش هرمي شکل موسوم به لبولهاي بيضه تقسيم ميکنند. اين ديواره ها کامل نبوده و معمولا ارتباطاتي بين لبول ها وجود دارد. هر لبول بوسيله يک تا چهار لوله مني ساز اشغال شده است (.(Junqueira, 2005 فضاي بين لوله ها توسط بافت همبندي غني از عروق خوني و لنفي، سلولهاي مختلف همبندي و سلولهاي آندوکريني اشغال شده است. بيضه به عنوان يک غده مختلط داراي دو بخش درون ريز وبرون ريز مي باشد. بخش درون ريز هورمونهايي نظير تستسترون، استروژن و اينهيبين ترشح ميکند و بخش برون ريز لوله هاي مني ساز هستند که اسپرماتوزوئيدها را ميسازند (Eurell, 2006).
3-1) آناتومي بيضه ها
بيضه غده زوجي است که به علت توليد سلولهاي جنسي، غده سلولزا ناميده ميشود(رجحان، 1376). شکل و اندازه آن در گونه هاي مختلف متفاوت ميباشد. براي توليد نرمال اسپرم، اين غده بايد حدود 1تا4 درجه سانتيگراد پايينترنسبت به متوسط درجه حرارت بدن قرار گيرند.تنظيم اين دما تا حدي بواسطه تبادل حرارتي از طريق عروق شرياني و وريدي انجام ميگيرد که به دور بافت بيضه پيچيدهاند (بيگدلي، 1383). عوامل ديگر کنترل دما عبارتند از تبخيرعرق از اسکروتوم و انقباض عضلات کرماستر در طناب اسپرماتيک که سبب کشيده شدن بيضهها به کانال اينگوينال شده و دماي آنها را افزايش ميدهد (Junqueira, 2005). وزن هر بيضه در انسان حدود 40 گرم ميباشد، قطر قسمت طولي بيضه حدود 5/4 سانتيمتر ميباشد. 80% بيضه يک فرد بالغ متشکل از لولههاي مولد مني است و 20% باقي مانده مربوط به کپسول و داربست بيضوي است که در داخل آن سلول هاي ليديگ پراکنده شدهاند (بيگدلي، 1383) .
4-1) اجزاي اصلي تشکيل دهنده بيضه
بيضه از عناصري مجزا که از نظر عملي با هم برهم کنش دارند تشکيل شده است.
جزء اول، سلولهاي ليديگ که سلولهاي ويژه توليد استروئيدي هستند. فراورده اصلي آنها تستسترون است که آثار موضعي مهم بر همانند سازي سلولهاي زايا و همينطور سلولهاي هدف دورتر دارد (بيگدلي، 1383).
جزء دوم، سلولهاي ميوئيد دور لولهاي، که در بيضه نابالغ تحت عنوان سلولهاي پيرامون لوله اي (Peritubular Cell) معروفند و با بلوغ جنسي تحت تأثير هورمونهاي هيپوفيزي و آندروژنها خاصيت انقباضي پيدا ميکنند (Eurell, 2006). دو نوع انقباض در اين لولهها ديده ميشود: نوع اول باعث به جلو راندن محتويات لوله ميگردد. اين نوع انقباض احتمالا در انتقال اسپرم رها شده به شبکه بيضه نقش دارد. نوع دوم: انقباض موضعي است وباعث دور کردن سلولهاي زاياي پيش ميوزي از غشاء پايه ميگردد و همچنين به رها سازي اسپرم در فرآيند اسپرم ريزي کمک ميکند (Lamp, 1988).
جزءسوم ، لولههاي مني ساز هستندکه اسپرماتوزوئيدها را توليد مي کنند. هر بيضه از250 تا 1000 لوله منيساز تشکيل شده است. هر لوله منيساز با يک اپيتليوم مطبق پيچيده مفروش شده است، قطرآن در انسان در حدود 250-150 ميکرومتر و طول آن حدود 30تا70 سانتيمتر است (Junqueira, 2005). لولههاي منيساز در هنگام تولد، توپر بوده و دو نوع سلول در آنها يافت ميشود. يک عدد سلولهاي درشت که همان P.G.C2 ها هستند و تقسيم شده، اسپرماتوگونيها را تشکيل ميدهند. دسته ديگر سلولهاي غيرمتمايز هستند که بعداً به سلولهاي سرتولي تبديل ميشوند. تا هنگام بلوغ، تقسيمات سلولي تجديد شده و تکامل P.G.C ها آغاز ميشود و لولههاي منيساز که تاکنون توپر بوده داراي مجرا ميشوند (بيگدلي،1383).
1-4-1) سلولهاي سري اسپرماتوژنز
سلولهاي متنوع و متفاوتي از بافت پوششي لولههاي منيساز هستند که در 4 تا 8 لايه در کنار يکديگر قرار گرفته و فضاي بين لايه قاعدهاي تا مجراي لوله را اشغال ميکنند. اين سلولها به ترتيب در برگيرنده چند نسل سلول هاي اسپرماتوگوني با عنوان گروه A وB روي غشاي پايه و سپس يک نسل اسپرماتوسيت اوليه، يک نسل اسپرماتوسيت ثانويه، يک نسل اسپرماتيد ويک نسل اسپرماتوزوئيد است(Eurell, 2006).
2-4-1) سلولهاي پشتيبان يا سرتولي
سلولهاي هرمي شکل هستند که قاعده آنها به لايه بازال ميچسبد، در حالي که انتهاي رأسي آنها معمولاً تا مجراي لوله منيساز امتداد مييابد. اين زوائد به عنوان مجراهايي هستند که سلولهاي زايا در مراحل مختلف رشد و تکامل دربين آنها قرار داشته و به سمت مجرا حرکت ميکنند. بعد از بلوغ اسپرماتوسيتها، اتصالات محکم جديدي بين زوائد سلولهاي سرتولي در پشت آنها پديد ميآيد و اتصالات قديمي جلوي آنها باز ميشود و به اين ترتيب بدون در هم ريختن جامعيت سد خوني- بيضوي که توسط سيتوپلاسم سلولهاي سرتولي ايجاد شده است، اسپرماتوسيتها از بخش قاعدهاي به بخش مجرائي عبور ميکند. سيتوپلاسم اين سلولها به عنوان فيلتر عمل کرده و تنها به مواد خاصي اجازه عبور ميدهند(بيگدلي، 1383). اين سد در حفظ سلولهاي زاياي جنس مذکّر در مقابل مواد مضر موجود در خون داراي اهميت است. در زير اين اتصالات، اسپرماتوگونيها در يک محوطه قاعدهاي قرار ميگيرند و در نتيجه به راحتي به مواد درون خون دسترسي مييابند. هنگام اسپرماتوژنز، سلولهاي اسپرماتوسيت لپتوتن نهايي و زيگوتن، از اين اتصالات گذشته و در محوطه جنب مجرايي قرار ميگيرند. از اينجا به بعد، مراحل پيشرفتهتر اسپرماتوژنز به کمک سد خوني- بيضوي از دسترس مواد موجود در خون حفظ ميشوند. سلولهاي سرتولي بوسيله اتصالات شکافدار نيز به هم متصل شدهاند که خود سبب ايجاد ارتباط يوني و شيميايي بين سلولها ميشود. چنانچه در انسان و حيوانات ديگر شرايط نامطلوبي مانند عفونت، سوء تغذيه و تشعشع اشعه X به سلول هاي سرتولي آسيب برساند، باعث اختلال سريع در فرايند اسپرماتوژنز ميشود و در صورتي که مرگ سلولهاي سرتولي رخ دهد، عدم باروري حاصل ميگردد که دائمي خواهدبود (Junqueira, 2005).
سلولهاي سرتولي با همکاري سد خوني- بيضوي اعمال زير را انجام ميدهند :
پشتيباني، حفاظت و تغذيه اسپرماتوزوئيدهاي درحال تکامل، فاگوسيتوز در حين اسپرميوژنز، سيتوپلاسم باقيمانده اسپرماتيدها به صورت اجسام باقيمانده از آنها جدا ميگردد. اين قطعات سيتوپلاسمي بوسيله سلولهاي سرتولي فاگوسيته شده و توسط ليزوزوم آنها تجزيه ميگردند علاوه براين چنانچه ذرات خارجي و باکتريها به اينجا رسيده باشند توسط سلولهاي سرتولي بيگانه خواري ميشوند (جلوگيري از واکنشهاي خود ايمني). سلولهاي سرتولي به طور مداوم مايعي به درون لولههاي منيساز ترشّح ميکنند که در جهت مجاري تناسلي جريان يافته و براي حمل اسپرم به کار ميرود. با کنترل هورمون FSH، يک پروتئين متصل شونده به آندروژن (ABP) ترشح ميکند که مسئول تغليظ تستوسترون در درون لولههاي منيساز ميباشد (رجحان، 1376). سلولهاي سرتولي قادر به تبديل تستسترون به استراديول هستند. اين سلولها پپتيدي به نام اينهيبين نيز ترشح ميکنند که ساخت و آزاد شدن FSH در بخش قدامي غده هيپوفيز را مهار ميکند. همچنين توليد هورمون آنتيمولرين، که يک گليکوپروتئين است و در دوره جنيني، تحليل مجاري مولر را در جنين مذکر تحريک ميکند (Junqueira, 2005).
5-1) بافت بينابيني
فضاهاي بين لولههاي منيساز در بيضه، بوسيله تجمعات بافت همبند، اعصاب، خون و عروق لنفاوي اشغال شدهاند. بافت همبند از سلولهاي مختلفي تشکيل شده است که عبارتند از: فيبروبلاستها، سلولهاي همبندي تمايز نيافته، ماست سلها و ماکروفاژها (Junqueira, 2005). در موش صحرايي ماکروفاژها مهمترين سلولهاي تشکيل دهنده بافت بينابيني در بيضه ميباشند (Lamp, 1988). به هنگام بلوغ نوع ديگري از سلول بنام سلولهاي بينابيني يا ليديگ ظاهر ميشود. اين سلولها هورمون مردانه، يعني تستوسترون را توليد ميکنند(Junqueira, 2005).
6-1) مجاري تناسلي داخل بيضه
مجاري دستگاه توليد مثل نر، مسئول ذخيره اسپرماتوزوآ پس از ترک بيضه ميباشند. اين مجاري عبارتند از:
1-6-1) لولههاي مستقيم
لولههاي مستقيم لولههاي کوتاه و بدون پيچ خوردگي بوده که لولههاي منيساز را به شبکه بيضه ارتباط ميدهند و توسط بافت پوششي مکعبي تا استوانهاي ساده مفروش ميشوند. در اين لولهها تبديل بافت پوششي از مکعبي مطبق لولههاي مني ساز به نوع ساده در محل اتصال لولههاي منيساز به لولههاي مستقيم ناگهاني بوده و سلولهاي سري اسپرماتوژنزبه تکرار نا پديد شده و تنها سلولهاي سرتولي تغيير شکليافته باقي ميمانند (Junqueira, 2005)
2-6-1) شبکه بيضه يا شبکه هالر
در ناحيه مدياستن بيضه واقع شده و داراي بافت پوششي از نوع سنگفرشي، مکعبي يا استوانهاي ساده است (Junqueira, 2005). کانالهاي اين شبکه در دوران جنيني ايجاد ميشوند اما اپيتليوم آنها تا شروع اسپرماتوژنز ساختار ويژه خود را پيدا نميکند. اين شبکه مايعات لوله منيساز را از طريق لولههاي مستقيم دريافت ميکند(Lamp, 1988).
3-6-1) مجاري آوران
مجراي آوران از شبکه بيضه خارج شده، در سر اپيديديم به يکديگر متصل ميگردند و مجراي منفرد اپيديديم را ايجاد ميکنند. در اپيديديم مجاري آوران دو نوع سلول ديده ميشوند. يکي مژهدار و ديگري بدونمژه که تعداد سلولهاي بدون مژه بيشتر است و اين سلولهاي داراي عملکرد ترشحي و جذبي ميباشند. زنش مژه در سلولهاي مژه دار به حرکت اسپرماتوزوئيدها به سمت اپيديديم کمک ميکند (Hermo, 1985).
4-6-1) مجراي اپي ديديم يا بربخ
اپيديديم در انسان و جوندگان آزمايشگاهي از سه بخش سر ،تنه و دم تشکيل شده است .سر اپي ديديم توسط مجاري آوران به بيضه متصل است و دم توسط بافت پيوندي در تماس با بيضه ميباشد. اپيديديم لولهاي منفرد و بسيار پيچ خورده است که به شکل طبيعي طول آن چند سانتيمتر است .اما طول کلي لوله بيش از 6 متر در انسان و 2 متر در رت ميباشد( Lamp, 1988). اپيتليوم اپي ديديم از نوع استوانهاي شبه مطبق با مژههاي ثابت (Stereocilia) ميباشد که اين مژههاي ثابت باعث افزايش سطح جذب و ترشح بافت اپي ديديم ميشود (Eurell, 2006). اسپرماتوزوئيدها در حين عبور از اپيديديم قابليت بارور ساختن مييابند و در مدتي که در اپيديديم حضور دارند، دستخوش تغييراتي در مورفولوژي، ترکيب و عملکرد ميگردند و سرانجام متحرک و بارور ميشودJunqueira, 2005)).
5-6-1) مجراي وابران
در امتداد اپيديديم قرار گرفته است، در انتها ناحيه وسيعي بنام، آمپول ايجاد ميکند و سپس دو شعبه ميشود. يک انشعاب به کيسه مني منتهي خواهد شد و انشعاب ديگر مجراي انزالي را تشکيل ميدهد که از ضخامت پروستات گذشته و به مجراي ادراري ميريزد (رجحان،. 1376).
6-6-1) مجراي انزالي
مجراي کوتاه و باريک ميباشد که از غده پروستات گذشته به پيشابراه پروستاتي منتهي ميشود و به هنگام انزال مايع مني توسط اين مجرا به پيشابراه هدايت شده و سپس به خارج برده ميشود لذا از اين به بعد مجراي ادراري با مجراي انتقال مني يکي ميشود (رجحان، 1376).
7-1) غدد ضميمه دستگاه تناسلي
بيشترحجم مايع سمينال شامل مواد ترشحي غدد ضميمه جنسي است.
غدد ضميمه عبارتند از:
1-7-1) کيسه مني
کيسه مني يا وزيکول سمينال به صورت يک جفت غده در سطح پشتي مثانه قرار گرفته است، مجراي وابران هر طرف به کيسه مني باز مي شود. ترشحات وزيکول سمينال ماده اي چسبنده است که در انسان ??-?? % حجم مايع مني را تشکيل ميدهد.pH ماده ترشحي قليايي است و نقش آن در خنثي کردن اسيديته مايع واژينال ميباشد. مايع سمينال غني از فروکتوز، ويتامين c و پروستاگلاندين است (رجحان، 1376). اسيد سيتريک نيز از مهمترين مواد ترشحي وزيکول سمينال در انسان و جوندگان است. ماده ديگري که توسط وزيکول سمينال ترشح ميشود کوآگولينوژن ميباشد که در تشکيل پلاک جفتگيري نقش دارد (Lamp, 1988. .(
2-7-1) پروستات( prostat)
پروستات در زير مثانه اولين بخش پيشابراه را احاطه کرده است. پروستات تأمينکننده ??-??% حجم مني مي باشد غدد پروستات به سه دسته تقسيم ميشوند: غدد مخاطي، غدد زيرمخاطي و غدد اصلي. اين سه دسته ترشحات خود را از اطراف به مجراي ادرار ميريزند. پروستات رت غني از فروکتوز و انواعي از پروتئينها ميباشد Lamp, 1988)).
3-7-1) غدد پيازي پيشابراهي
غدد پيازي پيشابراه (غدد کوپر)، اندامهاي کوچک جفت در دو طرف پيشابراه و در مجاورت بخش پيازي آن قرار گرفتهاند و توسط مجاري بلند به پيشابراهي که از اندام تناسلي عبور ميکند متصل ميگردند. ترشحات غده پيازي پيشابراهي متشکل از يک ماده شفاف، چسبنده و شبه موکوسي ميباشند. در انسان، اين ماده پيش از انزال آزاد شده وبه عنوان روان سازنده عمل ميکند، در حاليکه در جوندگان داراي يک ماده منعقد کننده است که در تشکيل پلاک جفتگيري نقش دارد (Lamp, 1988).
8-1) اسپرماتوژنز
فرآيند توليد اسپرماتوزوئيدها را اسپرماتوژنز ميگويند. اسپرماتوژنز در توبولهاي سمينيفر به طور معمول از??سالگي و در نتيجه تحريک هورمونهاي گنادوتروپيک هيپوفيز قدامي شروع ميشود و تا پايان زندگي ادامه مييابد (Guyton and Hall, 2006). توليد اسپرم بطور پيوسته در سرتاسر دوره زندگي توليدمثلي مرد انجام ميشود، تقريبأ ???-??? ميليون اسپرم روزانه توليد ميشود. براي توليد اين مقدار انبوه، نياز است که اسپرماتوگونيها با تقسيمات سلولي طي چرخه اسپرماتوژنز خود را تجديد کنند (Junqueira, 2005). چرخه اسپرماتوژنز در همه جانوران الگوي يکسان دارد و از سه مرحله مجزا تشکيل ميشود که عباتند از:
1-8-1) اسپرماتوسيتوژنز
اين فرآيند از يک سلول زاياي اوليه (اسپرماتوگوني) که مجاورلايه قاعدهاي قرار گرفتهاست، آغاز ميشود. به هنگام بلوغ جنسي، اين سلول دستخوش يک سري تقسيم ميتوز شده و سلولهايي که تازه تشکيل شدهاند، يکي از اين دو راه را انتخاب ميکنند: اين سلولها ممکن است بعد از يک يا چند تقسيم ميتوزي باز به تقسيم ادامه داده و به صورت سلولهاي بنيادي تمايز نيافته به نام اسپرماتوگوني نوعA درآيند و يا در حين چرخههاي پيش رونده ميتوزي به اسپرماتوگوني نوع B تمايز حاصل کنند. اسپرماتوگوني نوع B نيز به نوبت به اسپرماتوسيتهاي اوليه تبديل ميشود Junqueira, 2005)).
2-8-1) ميوز
اسپرماتوسيتهاي اوليه، کمي پس از تشکيل در اولين تقسيم ميوزي وارد پروفاز ميشوند. در اين هنگام اسپرماتوسيت داراي ?? کروموزوم وn?،DNA ميباشد. سلول در طي پروفاز يک، از چهار مرحله عبور ميکند- لپتوتن، زيگوتن، پاکيتن و ديپلوتن و وارد مرحله دياکينز ميشود که در اين مرحله کروموزومها از يکديگرجدا ميشوند. در طي اين مراحل از تقسيم ميوز، تقاطع ژنهاي ?? کروموزومي با يکديگر صورت ميگيرد. پس از آن سلول وارد مرحله متافاز ميشود و کروموزومها در مرحله آنافاز به سمت قطبها حرکت ميکنند. از آنجائيکه مرحله پروفاز در اين تقسيم در حدود ?? روز به طول ميانجامد، بيشتر سلولهايي که در مقاطع بافت شناسي مشاهده ميشوند، در اين مرحله قرار دارند. اسپرماتوسيتهاي اوليه بزرگترين سلولهاي دودمان اسپرماتوژن هستند. از تقسيم اول ميوز سلولهاي کوچکتري به نام اسپرماتوسيتهاي ثانويه که تنها داراي ?? کروموزوم (X+??،Y+??) هستند، حاصل ميشوند. اين کاهش تعداد کروموزوم از ?? به ?? همراه با کاهش مقدار DNA از n? به n? در هر سلول ميباشد. مشاهده اسپرماتوسيتهاي ثانويه در برشهاي بافتي مشکل است. چون اين سلولها داراي عمر کوتاه بوده و مدت زمان بسيار کوتاهي در مرحله اينترفاز باقي مانده (? تا ? روز) سريعاً وارد دومين مرحله تقسيم ميوزي ميگردند. از تقسيم اسپرماتوسيتهاي ثانويه، اسپرماتيدها به وجود ميآيند که داراي ?? کروموزوم هستند. چون مرحله s يعني مرحله سنتز DNA بين تقسيمات اول و دوم ميوزي اسپرماتوسيتها وجود ندارند، لذا مقدار DNA موجود در اسپرماتيدها به نصف مقدار DNA اسپرماتوسيتهاي ثانويه تقليل يافته و شامل n ? کروموزوم ميشود. بنابراين،فرآيند ميوز سبب تشکيل سلولهايي با تعداد کروموزومهاي هاپلوئيد (n?) ميشود. در هنگام لقاح سلولهاي جنسي، اين تعداد مجدداً به تعداد ديپلوئيد طبيعي ميرسد. در واقع فرآيند ميوز وجود تعداد ثابتي از کروموزومها را در هرگونه از جانوران تضمين ميکند(Junqueira, 2005).
3-8-1) اسپرميوژنز
اسپرماتيدها سلولهايي هستند که در نتيجه تقسيم ثانويه اسپرماتوسيتها به وجود ميآيند. اين سلولها را ميتوان به کمک اندازه کوچک آنها، هسته داراي کروماتين متراکم و قرارگيري در نزديکي مجراي لولههاي مني ساز تشخيص داد. اسپرماتيدها دستخوش يک فرآيند پيچيده تمايز، موسوم به اسپرميوژنز ميشوند که بطور خلاصه شامل مراحل زير است: تشکيل آکروزوم، متراکم و طويل شدن هسته، تشکيل تاژک و دفع مقدار زيادي از سيتوپلاسم به صورت اجسام باقيمانده نتيجه نهايي اين فرآيند توليد اسپرماتوزوئيد بالغ است که به واسطه فرآيندي موسوم به اسپرمياسيون به درون مجراي لولههاي مني ساز آزاد ميشود.
در تقسيم سلولهاي اسپرماتوگونيا، عمل سيتوکينز غيرکامل است، يعني سيتوپلاسم آنها از هم جدا نميشود. حاصل تقسيم يک اسپرماتوگونيا، تعداد زيادي اسپرماتوسيت اوليه، ثانويه و اسپرماتيد متصل بهم حاصل ميباشد که سيتوپلاسم آنها بوسيله پلي بهم متصل بوده و بصورت سين سي تيوم هستند و بعد از تکامل اسپرماتوزونها، اجسام باقيمانده از آنها جدا شده و هر اسپرم منفردا از زنجيره سينسيتيوم جدا ميشود (رجحان، 1376).
9-1) مورفولوژي اسپرم
اسپرم از لحاظ ساختماني به دو بخش سر و دم تقسيم ميشود. سر اسپرم در بيشتر گونهها از جمله پستانداران عمدتاً به شکل پهن و بيضي شکل است و در جوندگان سراسپرم داسي شکل ميباشند (ضميري، 1385).
1-9-1) سر اسپرم
سر اسپرم از دو جزء هسته و آکروزوم تشکيل شده است که شکل هسته و آکروزوم نماي سراسپرم را به وجود ميآورند.
الف- هسته: هسته سر اسپرم حاوي کروموزوم هاپلوئيدي است که اين کروموزومها بايد در هنگام باروري وارد تخمک شوند تا با ادغام با هسته تخمک تشکيل مجدد حيات 2n کروموزومي را دهند.از ويژگيهاي هسته اسپرم نسبت به هسته ساير سلولهاي سوماتيک اين است که علاوه بر اينکه n کروموزومي است، کروماتين در هسته بسيار متراکم و يکنواخت ميباشد (Eddy et al., 2004). مهمترين عاملي که باعث اين فشردگي شديد شده است، جايگزيني پروتئينهاي پروتامين به جاي پروتئينهاي DNA که هيستونها هستند ميباشد. اين تراکم و فشردگي باعث محافظت DNA در برابر صدمات فيزيکي و شيميايي ميشود (Knobi and Neills).
ب- آکروزوم: قسمت قدامي هسته توسط آکروزوم پوشيده شده است که دو غشاء داخلي و خارجي دارد و در انتهاي خلفي اين دو غشاء به همديگر متصل هستند. کلاهک آکروزومي مقادير متنابهي از آنزيمهاي هيدروليتيک و پروتئوليتيک را دارد. زماني که پديده ظرفيتگيري اسپرماتوزوآ در لوله رحمي صورت ميپذيرد، اين آنزيمها آزاد ميشوند و براي ايجاد نفوذپذيري در پرده شفاف اووسيتها وارد عمل ميشوند. ناحيه خلفي آکروزوم جايي است که کلاهک نازک شده و مواد درون آن متراکمتر ميشوند. اين ناحيه بخش استوايي آکروزوم اطلاق ميشود(Eurell A, 2006). ازجمله آنزيمهاي هيدروليتيک آکروزوم، آنزيم هيالورونيداز است که اسپرم توسط اين آنزيم اتصالات بين سلولهاي کومولوس را از بين ميبرد و خود را به تخمک ميرساند. آنزيم مهم ديگر آکروزين است که اسپرم توسط آن زوناپلوسيدا را تجزيه ميکند (ضميري، 1385).
2-9-1) دم اسپرم
دم يک ساختار تاژک مانند است که حرکت اسپرم را باعث ميشود و نيروي لازم براي حرکت اسپرم را فراهم ميکند (ضميري، 1385) و از ? قسمت گردن، قطعه مياني- اصلي و انتهايي تشکيل شده است.
ساختمان طبيعي اسپرم انسان
10-1) ارزيابي مورفولوژي اسپرم
بين ظاهر طبيعي اسپرم و تحرک آن، همبستگي مثبت وجود دارد. در تمام انزالها، تعدادي اسپرم غيرطبيعي حضور دارد. ارزيابي مورفولوژي اسپرم پس از رنگ آميزي با ائوزين- نگروزين انجام ميگيرد. اسپرمهاي غيرطبيعي به ? گروه زير تقسيم ميشوند:
الف- بدون دم ب- سر غيرطبيعي ج- ساختارهاي غيرطبيعي دم د- ساختارهاي غيرطبيعي دم، به همراه قطره سيتوپلاسمي پيشين ه- ساختارهاي غيرطبيعي دم، به همراه قطره سيتوپلاسمي پسين (Hafez, 2000).
11-1( تنظيم هورموني اسپرماتوژنز
مشخص شده است که محور GnRh – LH/ FSH – testis در روند اسپرماتوژنز ضروري است. مسأله بسيار مهم، آزاد شدن ضرباني GnRH و ورود ضرباني FSH و LH توسط هيپوفيز قدامي به سلولهاي هدف ميباشد. حداکثر ترشح هورمونهاي FSH و LH تنها زماني حاصل ميشود که GnRH به صورت يک جريان پالسي (ضرباني) ترشح ميشود. به نظر ميرسد که در ابتداي اسپرماتوژنز يعني تا مرحلهايي که اسپرماتوسيت اوليه تشکيل و به مرحله ميوزI وارد ميشوند هيچگونه کنترل هورموني بر اسپرماتوژنز وجود ندارد. در آغاز بلوغ جنسي با افزايش ترشح FSH تحريک سلولهاي سرتولي صورت ميگيرد، که اين تحريک براي شروع تقسيم ميتوز سلولهاي جنسي و همچنين در ابتداي تقسيم ميوز، لازم است. LH سلولهاي ليديگ را تحريک ميکند تا تستوسترون ترشح نمايند. تستوسترون به داخل سلولهاي سرتولي نفوذ مينمايد و در آنجا با تبديل به استراديول باعث ميشود که استراديول هم به عنوان يک هورمون تنظيم کننده در فرآيند اسپرماتوژنز مطرح شود.
هورمونهاي ديگرغده هيپوفيز در فرآيند اسپرماتوژنز نقشهاي جانبي ايفا ميکنند. به عنوان مثال بر روي سلولهاي ليديگ، رسپتورهاي پرولاکتين وجود دارد. اين هورمون باعث افزايش رسپتورهاي LH شده و به صورت همکاري با LHموجب تحريک توليد آندروژن ميشود. کمبود هورمون رشد به طور واضح شروع عمل دستگاه توليدمثل را به تأخير مياندازد. احتمالأ نقش هورمون رشد تحريک سلولهاي سرتولي براي توليد فاکتورهاي رشد شبه انسوليني است (Guyton and Hall 2006).همچنين گيرندههاي انسولين در سلولهاي ليديگ وجود دارند. انسولين عمل تحريکي هورمون LH در سنتز هورمون هاي استروئيدي را تنظيم مينمايد. ساير هورمونهاي موجود در گردش خون محيطي نظير گلوکوکورتيکواستروئيدها و هورمون هاي تيروئيدي بر عملکرد بافت بيضه تأثير دارند (Wang, 1999 ).
12-1) ظرفيت يافتن و واکنش آکروزومي اسپرماتوزوئيدها
ترميم: در بعضي از شرايط، آسيبهاي ايجاد شده توسط اکسيدانتها ميتواند ترميم شود.
35-1) زالزالک19
زالزالک، گياهي است برگريز از خانواده رزاسه که بومي نواحي مديترانه، شمال آفريقا، اروپا و آسياي مرکزي ميباشد. اين گياه بالغ بر ??? گونه گياهي دارد که اغلب گونههاي آن خارهايي برجسته، طويل، مستقيم و تيز با طولي بين يک تا پنج اينچ دارند (Rigelsky and Sweet, 2002). Crataegus monogyana و Crataegus laevigata دو گونه رايج اين گياه ميباشند. نخستين بار ??? سال پس از ميلاد مسيح، در تانگ-بن- کائو که اولين چاپي رسمي جهان است، به زالزالک اشاره شده است (Hou, 1977).
1-35-1)خصوصيات فيتوشيميايي
اغلب فعاليتهاي دارويي زالزالک به فلاونوئيدها و پروآنتوسيانيدينهاي اوليگومريک20 موجود در آن نسبت داده ميشود (Yao et al., 2008). مطالعات نشان دادهاند که فلاونوئيدها داراي خواص بيولوژيکي متعددي از جمله ويژگيهاي آنتياکسيدانتي ميباشند (Elliott Milddleton and Kandaswami, 2000). کوئرستين21، ايزوکوئرستين22، ويتکسين23، هايپروزيد24، اپيکاتچين25 و اسيد کلوروژنيک فلاونوئيدهاي فعال اصلي موجود در عصارههاي گياه زالزالک را تشکيل ميدهند (Yao et al., 2008).
2-35-1)ويژگيهاي داروشناختي
1-2-35-1) اثرات حفاظتي بر روي سيستم قلبي و عروقي
اين ويژگي دارويي گياه زالزالک به پروآنتوسيانينهاي اوليگومريک(OPCs) آن نسبت داده ميشود (Miller, 1998). بررسيها نشان داده است که عصارههاي اين گياه موجب افزايش توان انقباضي ميوکارد (Schwinger et al., 2000)، افزايش جريان خون کرونري(Schussler et al., 1995)، به کارگيري بهتر اکسيژن توسط کارديوميوسيتها (Muller et al., 1996)، کاهش بروز آريتميهاي قلبي که به واسطه از سرگيري جريان خون ايجاد ميگردند (Garjani et al., 2000)، کاهش فشار خون و درمان نارسايي احتقاني قلب (Hosseinimehr et al., 2008) ميگردند. مطالعات ديگري نيز در همين راستا از نقش حفاظتي عصارههاي اين گياه در برابر آسيبهاي ميوکاردي که به واسطه ايسکمي عروق کرونر و از سرگيري جريان خون به وجود ميآيند، در مدلهاي حيواني حکايت دارند (Veveris et al., 2004).
2-2-35-1) خاصيت کاهندگي چربي خون :
مطالعات پيشين نشان دادهاند که گونههاي متعددي از زالزالک داراي خواص کاهندگي چربي خون در حيوانات آزمايشگاهي ميباشند (Khalil et al., 2008). تحقيقات ديگري نيز بر اثرات سودمند زالزالک در کاهش کلسترول تام سرمي، ليپوپروتئين با چگالي کم26 و تري آسيل گليسرول27 در افراد داراي چربي خون صحه گذاردهاند (Kwon et al., 2005). همچنين گزارش شده است که عصاره آبي زالزالک موجب کاهش محسوس کلسترول آئورتي، استرکلسترول و کلسترول کبدي در خرگوشهاي تغذيهشده با جيره غذايي حاوي کلسترول بالا ميگردد (Khalil et al., 2008).
3-2-35-1) اثرات آنتي اکسيدانتي
تحقيقات صورت گرفته نشان دادهاند که عصارههاي حاصل از قسمتهاي مختلف گياه زالزالک داراي اثرات آنتياکسيدانتي بوده و قادر به مهار آنيون سوپراکسيد، راديکال هيدروکسيل، پراکسيدهاي هيدروژن و نيز پراکسيداسيون ليپيدي ميباشند (Bahorun et al., 1996). به نظر ميرسد فعاليتهاي آنتي اکسيدانتي و مهار راديکالهاي آزاد نتيجه عملکرد ترکيبات فنلي و فلاونوئيدهاي موجود در اين گياه باشد (Zhang et al., 2001). همچنين نقش محافظتي پروآنتوسيانيدينها در مهار استرس اکسيداتيو ناشي از ديابت مورد تأييد قرار گرفتهاست (Lee et al., 2007). علاوه بر اين، بررسيهاي به عمل آمده، ميوه زالزالک را به عنوان يک منبع غني از آنتي اکسيدانتها برشمردهاند (Ljubuncic et al., 2005).
علاوه بر ويژگيهاي دارويي فوق، گزارشاتي نيز پيرامون اثرات ضدويروسي گياه زالزالک (Shahat et al., 2002) و اثر محافظتي ميوه آن بر روي کوليت تجربي (Fujisawa et al., 2005) به چشم ميخورد.
36-1) عصاره هسته انگور
عصاره هسته انگور داراي طيف وسيعي از اثرات دارويي و درماني از قبيل فعاليتهاي آنتياکسيدانتي، ضدالتهابي، ضدميکروبي و همچنين داشتن اثرات محافظتي برعصب و قلب ميباشد. در طب گياهي دانههاي انگور به عنوان يک مکملهاي غذايي استفاده ميشود (et al., 2003 Shi). عصاره هسته انگورعمدتا شامل فلاونوئيدها ست، که در بهبود استرس اکسيداتيو در شرايط آزمايشگاهي و در vivo in موثر ميباشد (et al.,2002 Martinez-Florez). مطالعات مختلف نشان دادهاند که عصاره به دست آمده از دانه انگور سبب مهار سيستم آنزيمي که مسئول توليد راديکالهاي آزاد، مواد جهشزا و سرطانزاها ميباشد، ميشود (Li et al., 2001). عصاره هسته انگور غني از ترکيبات آنتياکسيدان بسيار قوي از جمله پروآنتيسيانيدين و پليفنولها ميباشد . اثر پروآنتيسيانيدين در بدن 20 برابر ويتامين Cو50 برابر ويتامين E است (Nassiri et al., 2009). اين ترکيبات آنتياکسيدان با خنثي نمودن راديکالهاي آزاد، جلو ي تخريب سلو لي ناشي از اثر راديکالهاي آزاد را ميگيرند(Shi et al., 2003) .
از تركيبات عملكردي هسته انگور ميتوان به چندين فلاونوئيد با يك ساختار فنولي اشاره كرد. که شامل فلاونولهاي مونومري، فلاونولهاي ديمري، فلاونولهاي تريمري، پروسيانيدينهاي پليمري ، موادي مانند کاتچين، اپيکاتچين ميباشد (Bagchi et al., 1997). در مجموع 75 درصد از پليفنولهاي انگور در پوست و دانه انگور موجود ميباشند. اما غلظت و ترکيب آنها به کشت جغرافيايي بستگي دارد. بنابراين، براي به دست آوردن عصاره با غلظت بالاي پليفنول از پوست و دانههاي انگور استفاده ميکنيم و ميتوان آنها را به عنوان يک مکمل به غذا اضافه کرد. با اين حال، برخي گزارشها نشان دادهاند که در غلظت بالا اثر فنول و ترکيبات آن در سلامت، منفي ميباشد. زيرا با افزايش ميزان محصولات آنتياکسيدان ، سرطانزايي آنها نيز افزايش مييابد (Fan and Lou, 2004). استرس اکسيداتيو بيضه ، يکي از ويژگيهاي مشترک در بسياري از موارد ناباروري مردان ميباشد، و نشان دادهاند که در موارد مربوط به hypospermatogenesis روشهاي درماني آنتي اکسيداني بهترين مورد ميباشد (Yousef and Salama, 2009). در تحقيق حاضر نيز مشاهده گرديد پارامترهاي مختلف اسپرمي در رتهايي که با عصاره هسته انگور تيمار شدهاند بهبود يافته، درصد اسپرمهاي زنده افزايش يافته، درصد اسپرم با DNA آسيب ديده و درصد اسپرمهاي نابالغ تا حدي کاهش يافتهاست. همچنين متعاقب بهبود اين پارامترهاي اسپرمي، پارامتر هاي مختلف لقاح مانند، درصد اووسيتهاي لقاحيافته، درصد تشکيل بلاستوسيستها، درصد جنينهاي دو سلولي افزايش مييابد. بسياري از اثرات بهداشتي مفيد GSE به مهار خواص آنتي اکسيدانتي و راديکالهاي آزاد نسبت داده شدهاست (Faria et al., 2006). اثر بهبود بخش GSE، ممکن است مربوط به منابع غني از ترکيبات فنلي مونومر مانند کاتچين، اپيکاتچين، پروآنتوسيانيدينهاي ديمر، تريمر و تترامر باشد) Escribano-Bailon et al.,1992). اين مولکولها داراي يک ساختار متکي به خاصيت آنتياکسيداني هستند ، که براي اعمال طيف جديدي از اثرات زيست شناختي، دارويي، درماني و شيمي محافظ در مقابل راديکالهاي آزاد اکسيژن و استرس اکسيداتيو (Bagchi et al.,1997) نشان داده شدهاست. GSE باعث مي شود روند استروئيدوژنز و از اين رو توليد تستوسترون و توليد اسپرم بهبود يافته و از اين رو باروري افزايش پيدا کند et al., 2007) Yousef). فلاونوئيدها ترکيباتي هستند که براي کاهش استرس اکسيداتيو وافزايش وضعيت آنتياکسيداني دروني و محافظت از سلولها در برابر آسيب توسط راديکالهاي آزاد و افزايش مقاومت در برابر استرس اکسيداتيو (Perez et al., 2002) نشان داده شده است. علاوه بر اين، گونههاي اکسيژن واکنشپذير و آسيب اکسيداتيو دو ملکولي با کاهش عملکرد اسپرم باعث ناباروري جنس نرميشوند ( Atessahin et al., 2005). درمان با GSE باعث اثر محافظتي در برابر سميت تناسلي ميشود و اين ممکن است به فعاليت GSE به عنوان يک آنتياکسيدان طبيعي نسبت داده شده است. در مطالعات اخير دريافتهاند که عصاره هسته انگور باعث مهار رشد و مرگ آپوپتوتيک سلولهاي 28DU145 سرطان پروستات انسان در محيط کشت آزمايشگاهي و انتقال عضو ميشود. سرطان پروستات به بدخيمي آندروژن وابسته است. مطالعات تکميل شده درمورد سرطان پروستات، نشان دادهاست که GSE باعث مهار رشد مستقل آندروژن پيشرفته انسان و مهار آپوپتوز سلولها DU145 ميشود.
37-1) توليدمثل در موشهاي صحرايي
موشهاي صحرايي به شکل گستردهاي در زمينههاي مختلف تحقيقات توليدمثلي مانند باروري، جنبههاي رفتاري توليدمثل و بررسي اثرات ناقص الخلقه زايي29 ترکيبات مختلف مورد استفاده قرار ميگيرند. آشنايي و شناخت ويژگيها و رفتار طبيعي توليدمثلي موشهاي صحرايي براي اين بخش از پژوهشهاي علمي، ضروري به نظر ميرسد.
1-37-1) بلوغ :
زمان آغاز بلوغ بين گونههاي مختلف موشهاي صحرايي متغير بوده و تحت تأثير فاکتورهاي متعدد ديگري نيز قرار ميگيرد. به عنوان مثال، آنهايي که سطح تغذيهاي بالاتري دارند، زودتر بالغ ميگردند (Bennet and Vickerg, 1970). به نظر ميرسد بلوغ در نتيجه افزايش توأم ميزان لپتين30 و تستوسترون حاصل ميشود (Nazian and Cameron, 1999). در موش صحرايي نر، بلوغ با پايين آمدن بيضهها به داخل اسکروتوم و آغاز اسپرماتوژنز همراه است. توليد اسپرم در بيضهها حدود ?? روزگي شروع ميگردد اما توليد بهينه31 آن تا حدود ?? روزگي رخ نميدهد (Russell, 1992). بلوغ در جنس ماده همزمان با بازشدن منفذ واژني در ??-?? روزپس از تولد و نخستين پرواستروس روي ميدهد. سيکل استروس حدود يک هفته پس از باز شدن منفذ واژني آغاز ميشود (Maeda et al., 2000).
2-37-1) رفتار توليدمثلي :
سه رويداد توليدمثلي معمول در موشها، در موشهاي صحرايي وجود نداشته يا بسيار ضعيف بروز ميکند. موشهاي صحرايي، اثر بروس32 که با به تأخير افتادن لانهگزيني جنينها در صورت حضور فرومونهاي توليد شده توسط موش نر جديد همراه است را نشان نميدهد. همچنين، اثر ويتن33 که به همزمان سازي سيکل استروس با ورود موش نر جديد در موش ماده اشاره دارد، در موشهاي صحرايي وجود ندارد. اثر لي بوت34 که به واسطه آن موشهاي مادهاي که در کنار هم نگهداري ميشوند، آنستروس ميگردند، ممکن است در موشهاي صحرايي وجود داشته باشد، اگرچه به اندازه موشهاي سوري بارز نيست (Sharp and LaRegina, 1998). لوردوزيس35، رفتار جفتگيري شاخص موشهاي صحرايي ماده ميباشد. اگرچه هر دو هورمون استروژن و پروژسترون در ايجاد اين رفتار نقش دارند، استروژن به تنهايي نيز قادر به القاء اين حالت خواهد بود. تستوسترون جهت بروز رفتار جفتگيري در موشهاي صحرايي نر ضروري است، چنانکه موشهاي نر اخته شده، هيچ نوع رفتار جنسي از خود نشان نميدهند. تحريکات شنوايي نقش مهمي در رفتار توليدمثلي هر دو جنس بازي ميکنند. صدايي 50 کيلوهرتزي توسط هر دو جنس نر درجريان جفت گيري ايجاد ميشود(Meada et al., 2000). جفتگيري در موشهاي صحرايي اغلب در آخرين بخشهاي چرخه تاريکي روي ميدهد (Mercier et al., 1987). جفتگيري به طور متناوب بالغ بر ? ساعت تداوم مييابد تا اينکه ??-? انزال روي دهد. جفتگيري ميتواند به وسيله حضور اسپرم در گسترش واژني، مشاهده پلاک واژني يا روئت مستقيم رفتار جفتگيري تاييد گردد.90 نا 94% حيواناتي که گسترش واژني آنها مثبت است، آبستن گزارش شدهاند (Baker, 1979).
3-37-1) دستگاه توليدمثلي موشهاي صحرايي نر
تعداد زيادي سلول زايگر اوليه در بدو تولد موشهاي صحرايي نر وجود دارد که تقريبأ ??% آنها در طول هفته اول زندگي دژنره ميشوند. هر بيضه تقريبأ داراي ??-?? لوله منيساز به شدت به هم پيچيده است که به صورت واضح توسط بافت فيبروزي تفکيک نميگردند (Russell, 1992). مدت زمان لازم براي تبديل اسپرماتوگوني به اسپرماتوزوئيد نسبتأ ثابت بوده و ??-?? روز به طول ميانجامد (de Kretser, 1982). چرخههاي اسپرماتوژنيک در موشهاي صحرايي بسيار جوان آغاز ميشود اما تا زمان بلوغ، ناکامل و نامنظم ميباشد. تقريبأ ? روز طول ميکشد تا اسپرماتوزوئيدها از سر اپيديديم عبور کرده و در دم آن تجمع يابند (Russell, 1992). ظاهراً ظرفيت توليدمثلي موشهاي صحرايي نر در مقايسه با جنس ماده طولانيتر است. آتروفي لولههاي منيساز در ??% موشهاي صحرايي نژاد Sprague-Dawley در ?? ماهگي و ??% موشهاي صحرايي نژاد F344 در ?? ماهگي گزارش شدهاست (Takashi, 1992). مطالعات صورت گرفته بر روي موشهاي صحرايي Long-Evas نشان داد که ميزان هورمون LH و تستوسترون به طور پيوسته با افزايش سن کاهش مييابد ( Smith et al., 1992). باروري در موشهاي صحرايي حدود ?? روزگي حاصل ميگردد (Clegg, 1960) و توانايي توليد استروژن توسط سلولهاي ليديگ با افزايش سن کاهش نمييابد (Kaler and Neaves, 1981). آتروفي لولههاي منيساز در موشهاي صحرايي ميتواند موضعي يا منتشر باشد که با طيفي از ديگر تغييرات بافتشناسي شامل واکوئل دار شدن لايههاي سلولهاي زايا، حضور سلولهاي غولپيکر چند هستهاي، چروکيدگي لولهها، افزايش ضخامت غشاهاي پايه و کاهش محسوس وزن بيضه همراه است.
اپيديديمها به واسطه مزانتري نازک به بيضهها متصل بوده و از سه قسمت سر، تنه و دم تشکيل ميگردند . آتروفي بيضهها معمولأ به صورت کاهش چشمگيراسپرمهاي بالغ در اپيديديمها بازتاب مييابد. کيسههاي مني به شکل جفت بوده و از محل اتصال پيشابراه به صورت قدامي امتداد مييابند. آتروفي اين اندامهاي جنسي به طور عمده در ارتباط با کاهش آندروژنها بوده که به صورت چروکيدگي و کاهش اندازه کيسهها تظاهر مييابد که از نقطه نظر بافتشناسي با حضور اجزاي ترشحي کوچک در حفره داخلي، تخريب اپيتليوم و افزايش استروماي فيبري-عضلاني همراه است. غده پروستات داراي چهار لوب است: پروستات قدامي يا غده انعقادي36، لوبهاي پشتي و جانبي که جداسازي آنها معمولأ دشوار است و لوب شکمي که غالبأ جهت بررسيهاي بافتشناسي مورد استفاده قرار ميگيرد. التهاب پروستات ممکن است ناشي از عفونت باکترياي باشد اما تنها به اين علت محدود نشده و نشان داده شده است که استرس ناشي از کاهش درجه حرارت، فضاي محدود و دسترسي محدود به آب و غذا ميتواند به التهاب غيرباکتريايي پروستات منجر گردد.حيواناتي که اخته شده يا دچار آتروفي بيضه گشته اند، آتروفي منتشر پروستات را به خصوص در لوب شکمي نشان ميدهند که ناشي از کاهش آندروژنها ميباشد. اين عارضه با کاهش ترشح، کاهش اندازه غده و افزايش استروماي فيبري-عضلاني همراه است. اجسام آميلاسه37، در آسينيهاي پروستات موشهاي صحرايي پير يافت شده و در لوبهاي پشتي و جانبي ميتواند موجب انسداد مجاري دفعي، التهاب و متاپلازي گردد. غده انعقادي در واقع لوب قدامي پروستات بوده و به دليل مجاورت با غده وزيکول سمينال معمولأ در مقاطع بافتشناسي اين اندام ديده ميشود. آتروفي منتشر اين غده گاهي در حيواناتي با آتروفي بيضه ديده ميشود ولي هيچ نوع هايپرپلازي و نئوپلازي در اين غده گزارشنشده است (Tucker, 2003).
38-1) توليد جنين در شرايط In vitro
اولين نوزاد متولد شده با استفاده از روش درماني IVF در سال 1978 به وسيله Edwards و Steptoe گزارش شد. اين روش درماني اميد تازهاي براي زوجهاي نابارور به وجود آورد. در آستانه قرن 21 انقلابي در زمينه استفاده از روش هاي بيوتکنولوژيک در مورد حيوانات اهلي صورت گرفت. اين تحولات با توليد موشهاي ترانس ژنيک توسط Brinster و همکاران آغاز گرديد و پس از آن به سرعت با توليد گاو، گوسفند و خوک هاي ترانس ژنيک (Wall et al.,1992) تعيين جنسيت عملي گاوSeidel et al., 2002) ) و توليد اعجاب انگيز گوسفند دالي که توسط Campbell و همکاران از سلول هاي سوماتيک شبيه سازي شده بود، ادامه يافت (Campbell et al.,19996). فناوري توليد جنين در شرايط آزمايشگاه به ما اجازهي توليد مقادير انبوه جنين در مراحل تکاملي گوناگون را ميدهد و از اين رو بسيار مورد استقبال دانشمندان علوم زيستي توليدمثلي وبيوتکنولوژي قرار گرفته است.
39-1) ظرفيت پذيري اسپرم
مادامي که اسپرمها مسير داخل لوله تناسلي ماده را طي نکردهاند ظرفيت کامل براي لقاح را ندارند. اسپرم بايد تغييرات فيزيولوژيکي تکميلي ( ظرفيت پذيري اسپرم) را الزاماً متحمل شود تا بتواند از لايهي شفاف عبور کرده و با تخمک ادغام شود. در واقع علت اين امرکه بسياري از آزمايشهاي ابتدايي مربوط به لقاح آزمايشگاهي ناموفق بودند، عدم ظرفيت پذيري مناسب اسپرم بوده است. در طي ظرفيتپذيري، غشاي پلاسمايي اسپرم متحمل واکنشهاي بيوشيميايي شده و ناپايدار ميگردد. در نتيجه اين واکنشها ميزان نفوذپذيري غشا به مواد مختلف به ويژه کلسيم تغيير ميکند. اين تغييرات ظاهرا به عنوان عامل اصلي براي واکنش آکروزومي عمل مينمايند. واکنشهاي آکروزومي موجب متراکم شدن، شکسته شدن و نهايتا متخلخل شدن غشاهاي پلاسمايي و خارجي آکروزوم ميشوند. آکروزوم حاوي آنزيمهايي است که پس از متخلخل شدن از آن خارج گشته و بافتهايي را که در اطراف تخمک در مسير حرکت اسپرم قرار دارند هضم نموده و از بين ميبرند و در نتيجه اسپرم قادر خواهد بود وارد تخمک شود و آن را بارور نمايد. مطالعات نشان ميدهد که شستشوي اسپرم قبل از انکوبه نمودن و قرار گرفتن در محيطهاي سرشار از يون و محيطهاي کلسيم دار ميتواند واکنش آکروزومي را در محيط آزمايشگاهي هدايت کرده و عمل لقاح را سرعت ببخشد (2002 (Wani,.
40-1) لقاح آزمايشگاهي(IVF)
اسپرم داراي ميزان زيادي پروتئين در سطح غشايي خود براي اتصال به پرده شفاف تخمک ميباشد. فرآيند لقاح آزمايشگاهي از زماني شروع ميشود که اسپرم به گيرندههاي پرده شفاف اووسيت ثانويه متصل ميشود. اين رسيتورها به طور اختصاصي عمل مينمايند به طوري که اسپرم موش قادر به بارور ساختن تخمک موش ميباشد. در فرآيند لقاح اووسيت توسط اسپرم فعال ميشود، به طوري که بدون هيچ گونه محرکي، اووسيت بايد قادر به تشکيل پرونوکلئوسها و ايجاد زايگوت باشد. باز شدن سر اسپرم 2-1 ساعت بعد از نفوذ در تخمک و شکلگيري پرونوکلئوس نر 5-3 ساعت از نفوذ رخ ميدهد (Hyttel et al., 1989). ازجمله تغييرات بيوشيميايي که در اثر نفوذ اسپرم حاصل ميشود، تغيير در الگوي يون کلسيم داخل سلول است که در طي پديده لقاح موجب القاي اگزوستيوز گرانولهاي کورتيکال و بلاک نمودن پلياسپرمي ميشود. عمدهترين مشکل در روند لقاح وقوع پلي اسپرمي است. در شرايط طبيعي (Invivo) دستگاه توليد مثلي ماده باعث کاهش تعداد اسپرم رسيده به تخمک ميشود (., 1993 Sun et al).
نگهداري اسپرم و تخمک در خلال برنامههاي بلوغ تخمک، ظرفيت پذيري اسپرم و لقاح يافتن تخمکها در شرايط گرم خانه اي مخصوص (37 درجه سانتيگراد، 5%گاز co2 و حداکثر رطوبت) انجام ميگيرد (Kim et al., 1998). براي مشاهده لقاح ميتوان با مطالعه ميکروسکوپي و يا با رنگ آميزي و تثبيت نمودن تخمکها 24-18 ساعت پس از لقاح به وقوع کليواژ پيبرد. درصد بالاي لقاح در IVF به وجود تعداد مناسب اسپرمهاي باروري که به شدت متحرک بوده و تخمکهاي باروري که داراي اولين گويچه قطبي هستند، بستگي دارد.
بعضي از معيارهايي که به عنوان نشانه لقاح بکار ميروند عبارتند از:
نفوذ اسپرم به داخل اووپلاسم
تورم سر اسپرم، تشکيل پيش هسته نر
تسهيم با ظاهر طبيعي، در جهت تشکيل بلاستومر
متلاشي شدن دانههاي قشري
مشاهده دم يک اسپرم در اووپلاسم
هيج يک از موارد فوق به تنهايي نميتواند بيانگر لقاح طبيعي باشد، چرا که براي نمونه رويانهاي حاصل از بکرزايي هم، بعضي از معيارهاي فوق را دارا هستند (, 1998.Kim et al).
41-1) مروري بر مطالعات انجام گرفته بر روي داروي سيکلوسپورين و عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور
Seethalakshmi وهمكاران در سال 1987 براي اولين بار اثرات مصرف CsA روي سيستم توليد مثلي بيماران پيوندي را بررسي کردند. و گزارش کردند سيکلوسپورين آ باعث تغييرات تخريبي و آتروفي لولههاي منيساز، كاهش تعداد و حركت اسپرم و بدشكليهاي اسپرم در مجاري اپيديديم شده و در نتيجه منجر به ناباروري مردان ميگردد.
Chen و همکارانش در سال 1988به اين نتيجه رسيدند که اثرات تجويز روزانه CSA با دوز mg/kg10 بر پارامترهاي ساختاري بيضه اثر چنداني ندارد.
Srinivas و همکاران در سال 1998 و Masuda و همکاران در سال 2003 نشان دادند سيکلوسپورين آ از طريق تضعيف روند تكاملي اسپرم، كاهش فعاليت فاگوسيتوزي سلول هاي سرتولي، كاهش وزن بيضه، كاهش تعداد اسپرمها ، كاهش سطح تستوسترون و افزايش سطح FSH و LHسرم باعث آسيب ساختار بافتي بيضه شده و در عمل كرد آن اختلال ايجاد ميكند.
Turk و همكاران 2010 اثرات CsA بر روي سيستم توليد مثلي موشهاي صحرايي نر را بررسي کردند آنها مشاهده کردند که سيکلوسپورين آ با دوز mg/kg 10در سال 1988 بر پارامترهاي ساختاري بيضه اثرات مخرب دارد.
Sirinivas در 1988 گزارش كرد كه در موشهاي صحرايي تحت درمان با سيكلوسپورين (دوز 20 ميلي گرم بر كيلوگرم وزن بدن ) تعداد اسپرمها, جمعيت سلولهاي هاپلوئيد مجاري منيساز و سطح تستوسترون سرم كاهش معني داري پيدا ميكنند.
Masudaدر 2003 نشان داد كه CsA باعث كاهش تعداد اسپرماتوزوآ، بدشكليهاي اسپرماتيدها، افزايش اجسام باقيمانده، تغييرات دژنراتيو شديد در مجاري مني ساز و افزايش اسپرماتيدهاي گرد دژنره شده و اسپرم هاي غيرطبيعي در مدت دو هفته پس از مصرف ميگردد.
بهمنپور و نامآور ( 1379 ) در مطالعههايي در خصوص تأثير سيكلوسپورين بر حاملگي و ميزان مرگ و مير جنين در موش سوري گزارش كردند كه سيكلوسپورين با دوز50 ميليگرم به ازاء هر كيلوگرم وزن بدن روزانه، موجب افزايش ميزان مرگ و مير جنين و كاهش نوزادان ميگردد.
Li و همکاران در سال 2001، Maier و همکاران در سال 2009، نشان داده اند که عصاره به دست آمده از دانه انگور سبب مهار سيستم آنزيمي که مسئول توليد راديکال هاي آزاد، مواد جهش زا و سرطان زاها ميباشد، ميشود .
Martinez-Florez و همکاران در سال 2002، عصاره هسته انگورعمدتا شامل فلاونوئيدهاست، که در بهبود استرس اکسيداتيو در شرايط آزمايشگاهي و در vivo in موثر مي باشد.
Shi و همکاران در سال 2003، ترکيبات آنتياکسيدان با خنثي نمودن راديکال هاي آزاد، جلوي تخريب سلولي ناشي از اثر راديکالهاي آزاد را ميگيرند.
Faria و همکاران در سال 2006، بسياري از اثرات بهداشتي مفيد GSE به مهار خواص آنتياکسيداني و راديکالهاي آزاد نسبت دادند.
Yousef و همکاران در سال 2007، عصاره هسته انگور باعث ميشود روند استروئيدوژنز و از اين رو توليد تستوسترون و توليد اسپرم بهبود يافته و از اين رو باروري افزايش پيدا کند.
Ljubuncic و همکاران در سال 2005 ميوه زالزالک را به عنوان يک منبع غني از آنتي اکسيدانتها برشمردهاند.
Yao و همکاران در سال 2008 گزارش کردند که اغلب فعاليتهاي دارويي زالزالک به فلاونوئيدها و پروآنتوسيانيدينهاي اوليگومريک موجود در آن نسبت داده ميشود .
Khalil و همکاران در سال 2008 نشان دادهاند که گونههاي متعددي از زالزالک داراي خواص کاهندگي چربي خون در حيوانات آزمايشگاهي ميباشند.
*فصل دوم
مواد و روشها
?-2) مواد:
-محيط کشت mR1ECM براي تهيهي رقت مناسب از اسپرم
– رنگ ائوزين-نگروزين جهت رنگآميزي اسپرمهاي زنده و مرده
– محلول فرمالين ??% جهت فيکس نمودن بافت بيضه موشها
– داروي سيکلوسپورين بصورت کپسول
– رنگ ائوزين
– رنگ هماتوکسيلين
– الکل اتيليک مطلق و ?? درجه
– محلول گزيلل (زايلين)
– محلول آلبومين
– گليسرول
– چسب انتالان
– کربنات ليتيم
– پارافين
– محلول اسيد- الکل
– محلول کلروفريک
?-2) وسايل و دستگاهها
-ترازوي حساس براي توزين رتها و داروها
– سرنگ انسولين ??? واحدي جهت گاواژ دارو
– انکوباتور co2
– ست جراحي
– سمپلر براي برداشتن نمونه و انتقال آن به لولههاي آزمايش
– دستگاه سانتريفوژ
– لام و لامل
– قلم الماس
– ميکروتوم
– قالبهاي پارافين و کرايوستات
– ظروف مخصوص رنگآميزي
– عدسي مدرج و مشبک
3-2) آمادهسازي عصارههاي آبي
1-3-2) تهيه عصاره هسته انگور
انگور قرمز از باغهاي اطراف شهرستان اروميه تهيه و پس از شستن و خشک کردن، هستهها از ميوه جدا و آسياب شدند. مقدار 25 گرم پودر هسته انگور به 250 ميليليتر آب مقطر اضافه و به مدت 24 ساعت در دماي 40 درجه سانتي گراد در انکوباتور نگهداري شد. روزانه به مدت 3 ساعت بر روي دستگاه روتاتور با 200 دور در دقيقه چرخانده و بعد با کاغذ صافي واتمن شماره يک فيلتر و سپس حلال محلول فيلتر شده، با دستگاه تبخير کننده چرخان تبخير شد و عصاره خشک بدست آمد. اين عمل 3 بار تکرار شد و کل نمونه ها جمع آوري و در يخچال تا زمان انجام آزمايش در دماي 20- نگهداري شد (Harborne, 1998).
2-3-2) طرز تهيه عصاره زالزالک
براي اين منظور ، ميوههاي زالزالک پس از جمعآوري از مناطق رشد آن در اطراف شهرستان اروميه و تاييد توسط بخش گياهشناسي دانشکده علوم دانشگاه اروميه، به مدت 10 روز در دماي آزمايشگاه و دور از نور مستقيم آفتاب، خشک و آسياب گرديدند. سپس 25 گرم از پودر به دست آمده در 250 ميلي ليتر آب مقطر به مدت 15 دقيقه در دماي 100 درجه سانتيگراد جوشانده شده، جوشانده حاصل با استفاده از کاغذ صافيهاي معمولي و متعاقبا کاغذ صافي واتمن (Whatman) شماره يک صاف ميگرديد. اين جوشانده صاف شده نيز در دستگاه حذف حلال، تحت شرايط خلاء و در دماي 56 درجه سانتي گراد تغليظ ميگرديد. پس از تغليظ نهايي و خشک شدن، عصاره آبي نهايي به 4/12% وزن اوليه رسيد. اين عصاره آبي تهيه شده نيز تا زمان مصرف در دماي 18- سانتي گراد نگهداري ميشد (Ljubuncic et al., 2005).
4-2) حيوانات
در اين تحقيق از 32 رت نر بالغ نژاد Wistar در محدوده وزني ??±?0? گرم جهت انجام آزمايشات استفاده گرديد. حيوانات در خانه حيوانات گروه زيست شناسي دانشکده علوم دانشگاه اروميه تحت شرايط استاندارد (?? ساعت روشنايي و ?? ساعت تاريکي ) و درجه حرارت ?± ??درجه سانتيگراد در قفسهاي مخصوص پرورش و نگهداري ميشدند. اين حيوانات توسط پليت تغذيه شده و جهت آبدهي از شير آب شهري استفاده ميشد.
5-2) تعيين حيوانات و دوز مؤثر دارو
موشهاي نر حدود دو ماه پس از تولد بالغ ميشوند و قادر به توليد حداکثراسپرم روزانه و بارورکردن موش هاي ماده ميشوند. در رت ماده نيز 50-70 روز پس از تولد بلوغ جنسي اتفاق ميافتد. بررسي مطالعات پيشين بر روي سيکلوسپورينآ نشان مي دهد که تيمار سيکلوسپورين با دوز mg/kg/day40 باعث اختلال در باروري رتها ميشود (Hiroshi et al., 2003). بنابراين ميزان دوز تجويزي mg/kg/day40 انتخاب شد (بصورت محلول در نيم سيسي روغن کنجد) . ميزان دوز تجويزي عصاره زالزالک ((Max et al., 2003 و عصاره هسته انگور(ميرزايي ع و همکاران.، 1390) mg/kg/day150انتخاب شد.
6-2) گروه بندي حيوانات
32سر رت نر بالغ به طور تصادفي به ? گروه ? تايي تقسيم شدند و به صورت زير تحت رژيم دارويي قرار گرفتند:
حيوانات گروه اول جهت حذف استرس تزريق به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. اين گروه بجز آب و غذا ترکيب ديگري دريافت نکردند.
حيوانات گروه دوم بمدت?? روز ، روزي يک بار دارو ي سيکلوسپورين را به صورت گاواژ دريافت کردند.
حيوانات گروه سوم به مدت ?? روز ، روزي يک بار داروي سيکلوسپورين را به همراه عصاره هسته انگور به صورت گاواژ دريافت مي کردند.
حيوانات گروه چهارم به مدت ?? روز، روزي يک بار داروي سيکلوسپورين را به همراه عصاره زالزالک به صورت گاواژ دريافت ميکردند.
7-2) بررسيهاي بافتشناسي
قبل از شروع آزمايش و گاواژ دارو، رتهاي نر بالغ به مدت ?? روز در مرکز پرورش و نگهداري حيوانات آزمايشگاهي درکنار هم و به صورت گروهبندي شده قرار داده شدند تا با شرايط محيط سازش پيدا کنند و استرسهاي محيطي بر نتيجه آزمايشها هيچگونه تأثيري نداشته باشد. در پايان دوره تيمار (?? روز پس از آخرين تزريق)، رت ها به روش جابجايي مهرههاي گردن آسان کشي شد. بيضه سمت چپ را پس از پاساژ بافتي با H&E و PAS رنگ آميزي نموده و بيضه سمت سمت راست را جهت مطالعات هيستوشيميايي و هيستومورفومتري به کرايواستات انتقال داده شد و پس از تهيه مقاطع کرايواستات با سودان بلاک رنگآميزي شدند و از آنها تصاويري با دوربين ديجيتالي تهيه و مورد مطالعه قرارگرفتند.
8-2) روش تهيه محلول ثبوتي فرمالين 10درصدي نمکي
کلريد سديم 9گرم
آلدئيد فرميک 100ميلي ليتر
آب مقطر 900 ميلي ليتر
9-2) پاساژ بافتي
بافتهاي تثبيت شده در فرمالين داراي مقدار زيادي آب هستند که اين آب ميتواند در تهيه مقاطع بافتي اختلال ايجاد کند، لذا آبگيري از بافتها جهت بوجود آمدن قوام و سفتي ضروري به نظر ميرسد. اين اعمال طي پاساژ يا گردش بافت صورت ميگيرد. مراحل پاساژ بافت عبارتند از:
1-9-2) آبگيري (dehydration)
براي آبگيري از الکل اتانول با غلظتهاي صعودي به شرح زير استفاده شد:
1- الکل 70 درجه 1 ساعت
2- الکل 80 درجه 1 ساعت
3- الکل 90 درجه ?/1 ساعت
?- الکل مطلق I 1 ساعت
?- الکل مطلق II 1 ساعت
2-9-2) شفافسازي (clearing)
اين مرحله به منظور زدودن کدورت و افزايش شفافيت بافت ميباشد. گزيلول (زايلين) به عنوان ماده شفاف کننده استفاده ميشود. زيرا اين ماده هم در الکل و هم در پارافين قابل اختلاط است و به برداشتن يا تميز کردن الکل کمک ميکند و چون مادهاي فرار است با قرار گرفتن در حمام پارافين به آساني تبخير شده و پارافين مايع جاي آن را ميگيرد.
مراحل شفافسازي به صورت ذيل انجام گرفت:
1- محلول گزيلول + روغن سدر 1 شب
2- محلول گزيلول 1 ساعت
3-9-2- نفوذ و آغشتگي
در اين مرحله براي نفوذ و آغشتگي، بافتها به يک حمام پارافين در يک کوره با دماي C?60-56 (دماي ذوب پارافين) منتقل شدند. در حين اين عمل گزيلل از بافتها با پديده انتشار خارج شده و تبخير ميگردد و متعاقب آن پارافين براي جانشين شدن گزيلل به داخل بافت انتشار مييابد.
مراحل آغشتگي به صورت ذيل انجام گرفت:
1- پارافين مذاب 1ساعت
2- پارافين مذاب II 1ساعت
3- پارافين مذاب III 2 ساعت
?-9-2) قالبگيري
بعد از اينکه بافتها مراحل ثبوت و پاساژ بافتي را گذراندند. براي تهيه مقاطع ميکروسکوپي لازم است که اين قطعات در بلوکهاي پارافيني قالبگيري شوند و براي برش توسط ميکروتوم آماده شوند. براي قالبگيري ابتدا لازم است که پارافين را ذوب نموده و در داخل قالبهاي مخصوص ريخته و سپس بافت را بوسيله يک پنس گرم برداشته و در پارافين مذاب قرار دهيم به طوري که سطح برش به طرف کف ظرف قرار گيرد. به منظور شناسايي نمونهها، بر روي هر يک از بلوکهاي پارافيني تهيه شده، شماره يا نام مربوط به هر نمونه را با مداد نوشته و نصب ميشود. پس از سرد شدن پارافين و منجمد شدن آن قالبها را جدا کرده و بلوکهاي پارافيني جهت نگهداري به يخچال منتقل گرديدند.
5-9-2) برش بافت و ثابت کردن مقاطع بافتي بر روي لام
در اين مرحله قالبهاي پارافيني را از يخچال خارج کرده و با استفاده از دستگاه ميکروتوم دوار برشهايي با ضخامت ? تا 7 ميکرون از بافت مورد نظر تهيه ميشود. برشهاي حاصل را به حمام آب گرم با دماي C?45 منتقل کرده و با اين کار چين خوردگيهايي که حين برش بوجود آمده بود از بين ميروند. براي چسباندن نمونهها به لام از چسب آلبومين استفاده ميکنيم. سپس لامها به مدت 2? ساعت در هواي آزمايشگاه باقي ماندند تا کاملأ خشک شوند.
?-9-2) طرز تهيه چسب آلبومين
سفيده تخممرغ و گليسرول را به نسبت مساوي با هم مخلوط کرده و يک قطعه تيمول به عنوان محافظ براي جلوگيري از رشد باکتريها و قارچها به آن اضافه ميشود. بعد از آماده نمودن محلول آلبومين، لامهاي تميز و خشک را برداشته يک قطره از محلول را روي هر يک از آنها قرار داده، بعد با نوک انگشت آن را در سطح لام پخش ميشود. بعد از آماده شدن لامها، مقاطع بافتي را که در حمام آب گرم شناور هستند به روي لامها منتقل نمودند. اکنون لامها براي رنگآميزي آماده هستند.
10-2) رنگ آميزي مقاطع بافتي
براي بررسي خصوصيات فيزيکي اجزاء سلولي و ارتباطات بافتها، برشهاي مورد نظر بايد مورد رنگآميزي قرار گيرند. اما قبل از انجام رنگآميزي بايد پارافين از مقطع روي اسلايد برداشته شود. براي اين منظور و آبدهي به بافتها، اسلايدها را به ترتيب از محلولهاي ذيل عبور ميدهيم.
1- محلول گزيلل I 3 دقيقه
2- محلول گزيلل II 3 دقيقه
3- محلول گزيلول III 3 دقيقه
?- الکل 96 درجه 3 دقيقه
?- الکل 90 درجه 3 دقيقه
?- الکل 80 درجه 3 دقيقه
7- الکل 70 درجه 3 دقيقه
بدين ترتيب مقاطع براي رنگآميزي آماده ميگردند.
11-2) رنگآميزي هماتوکسيلين و ائوزين (H&E)
جهت انجام اين رنگآميزي، لامهاي آماده شده در مراحل قبل را به ترتيب از محلولهاي ذيل عبور ميدهيم.
1- محلول هماتوکسيلين هاريس 13-10 دقيقه
2- شستشو در آب جاري
3- محلول اسيد – الکل 3 ثانيه
?- شستشو در آب جاري
?- محلول کربنات ليتيوم اشباع ?-3 دقيقه
?- شستشو در آب جاري
7- محلول ائوزين 7 دقيقه
8- شستشو در آب جاري
9- الکل 70 درجه 03-1? ثانيه
10- الکل 80 درجه ??-30 ثانيه
11- الکل 90 درجه 3 دقيقه
12- الکل 96 درجه 3 دقيقه
13- محلول گزيلل I 3 دقيقه
1?- محلول گزيلل II 3 دقيقه
1?- محلول گزيلل III 3 دقيقه
1-11-2) طرز تهيه اسيد الکل
براي تهيه اسيد الکل 100 ميليليتر الکل اتيليک 70 درجه با 10 ميليليتر اسيد کلريدريک غليظ مخلوط شد.
2-11-2) طرز تهيه رنگ ائوزين
براي تهيه محلول رنگ ائوزين، يک گرم ائوزين در 100 ميليليتر آب مقطر حل شده و يک قطعه تيمول به عنوان محافظ به آن افزوده شد.
نتيجه رنگآميزي : هسته سلول به رنگ آبي تيره تا سياه و سيتوپلاسم به رنگ صورتي در ميآيد.
بعد از اتمام رنگ آميزي، يک قطره از چسب انتالان را روي لامل ميگذاريم و سپس به آرامي لامل حاوي چسب را بر روي لام حاوي بافت قرار ميدهيم و لامل را روي آن ميچسبانيم. اکنون لام براي مطالعه با ميکروسکوپ نوري آماده است. با استفاده از اين رنگ آميزي قطر لولههاي منيساز، ضخامت اپيتليوم لولههاي منيساز، ضخامت بافت پيوندي ما بين لولهها، درصد تمايز لولهاي و درصد اسپرميوژنز محاسبه گرديد.
3-11-2) طرز تهيه رنگ هماتوکسيلين هاريس
هماتوکسيلين 1گرم
الکل اتيليک مطلق 10-20 ميلي ليتر
آلوم آلومينيوم 20 گرم
آب مقطر 200 ميلي ليتر
اکسيد مرکوريک 5/0 گرم
هماتوکسيلين در الکل و آلوم آلومينيوم در آب مقطر در مجاورت کمي حرارت حل گرديده، دو محلول فوق با هم مخلوط شده و به سرعت جوش آورده شدند. در همان موقع اکسيد مرکوريک به آن اضافه شده و با قرار دادن در آب سرد سريعاً خنک گرديد.
12-2) ارزيابي هيستو مورفومتريک بيضه
پس از تهيه مقاطع بافتي و رنگ آميزي هماتوکسيلين ائوزين، جهت انجام ارزيابي هاي هيستومورفومتريک بيضه نظير بررسي قطر لولههاي منيساز، ارتفاع اپيتليوم لولههاي منيساز، ضخامت بافت بينابيني، قطرکپسول بيضه و قطرهسته سلولهاي ليديگ و سرتولي در گروههاي مختلف آزمايشي، عدسي چشمي مدرج مورد استفاده قرار گرفت (Elias and Hyde, 1980).
شمارش تعداد مقاطع لولههاي منيساز، ماستسل ها، سلولهاي ليديگ و سلولهاي ايمني تک هستهاي در واحد سطح بيضه نيز با استفاده از عدسي چشمي مشبک انجام پذيرفت (Gunderson, 1977). لازم به ذکر است که به منظور مطالعه و شمارش ماست سلها، روش رنگ آميزي تولوئيدين بلو جهت رنگآميزي مقاطع بافتي مورد استفاده قرارگرفت (Gaytan et al., 1992). مقايسه تعداد سلول هاي اسپرماتوگوني، اسپرماتوسيت اوليه، اسپرماتيد و سلول هاي سرتولي لوله منيساز در گروههاي مختلف آزمايشي نيز به واسطه شمارش اين سلول ها در 100 لوله منيساز صورت گرفت(Humason, 1979) .
13-2) آمادهسازي موش براي IVF
جهت انجام اين مطالعه به 12 رت ماده بالغ 5/7 واحد هورمون PMSG38 (ساخت شرکت Folligon هلند) به حجم 1/. ميلي ليتر و 48-46 ساعت بعد از تزريق 5/7 واحد هورمون HCG39(ساخت شرکت Folligon هلند) به حجم1/. ميلي ليتر به روش داخل صفاقي (40IP) صورت گرفت. عمل تخمکگذاري معمولاً 12-10 ساعت پس از تزريق HCG صورت ميگيرد.
1-13-2) آمادهسازي محيط کشت براي IVF
روز پيش از لقاح محيط کشتهاي لازم براي انجام عمل لقاح تهيه شده و به مدت 12 ساعت در انکوباتور با ترکيب گازي %5 CO2 در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار ميگرفت. ديشهاي لقاح با محيط کشت mR1ECM قطره گذاري مي شوند. يک قطره 500 ميکروليتري در هر ديش براي لقاح و چندين قطره 100ميليليتري براي شستشو در ديشهاي IVF گذاشته ميشوند و سطح روي آنها با روغن معدني (mineral oil- sigma) پوشانيده ميشد.
2-13-2) طرز تهيه محيط کشت mR1ECM
استوک A :کلريد سديم 42/6 گرم، کلريد پتاسيم 239/0 گرم ، گلوکز 352/1 گرم ، پنيسيلين جي 075/0 ، استرپتومايسين 050/0 گرم لاکتات سديم 9/1 ميلي ليتر را در 100 ميلي ليتر آب سه بار تقطير حل کرده و سپس با استفاده از فيلتر 20/0 فيلتر نموده و تحت عنوان استوک A در داخل يخچال 4 درجه سانتي گراد قرار داده شد.
استوک B :براي تهيه آن کلريد کلسيم به ميزان 294/0 گرم و کلريد منيزيم 102/0 گرم را در 100 ميلي ليتر آب دو بار تقطير حل نموده و بعد از فيلتر کردن در يخچال4 درجه سانتي گراد نگهداري گرديد.
در داخل يک فلاکس محيط کشت 10 ميلي ليتر از استوکA و 10 ميلي ليتر از استوکB را ريخته و به آن 210/0 گرم بي کربنات سديم ، 0055/0 گرم پيرووات سديم ، 0146/0 گرم گلوتامين ال ، 2 ميلي ليتر اسيدهاي آمينه ضروري و 1 ميلي ليتر اسيدهاي آمينه غير ضروري اضافه نموده سپس حجم آن را با استفاده از آب سه بار تقطير به 100 ميلي ليتر رسانده و محيط را فيلتر و مورد استفاده قرار داديم (, 2006 Mark).
3-13-2) تهيه اسپرم :
براي تهيه اسپرم از رتهاي تحت تيمار استفاده شد. رتها به روش جابجايي مهرههاي گردن آسانکشي شد. سپس پوست ناحيه شکمي با اتانول %70 استريل شده و با ايجاد برش در ناحيه شکم و بعد از جداکردن بافتهاي همبندي اطراف، دم اپي ديديم همراه با مقداري از کانال دفران از بيضه جدا و در داخل پتريديش 2 سانتي متري محيط کشت mR1ECM ، که قبلاً جهت تعادل در داخل انکوباتور قرار داده شده بود قرارگرفت و پس از ايجاد چند برش در دماپي ديديم و فشار در کانال دفران، براي خروج اسپرمها در داخل انکوباتور Co2 گذاشته شد. بعد از 30 دقيقه اسپرمها خارج شده و در محيط پخش ميشدند، سپس اسپرمها را شستشو داده و با استفاده از روش شناورسازي اسپرمهاي متحرک را جدا نموده و جهت ظرفيتيابي اسپرم به مدت 6-5 ساعت در انکوباتور co2 با دماي 37 درجه سانتيگراد قرار داده شدند.
4-13-2) روش گرفتن تخمک بالغ و لقاح داخل آزمايشگاهي(IVF):
بين 10 تا12 ساعت پس از تزريق HCG (صبح روز بعد)، بعد از آسان کشي حيوان به روش جابجا کردن مهرههاي گردن، لوله هاي رحمي به همراه قسمت کوچکي از رحم جدا شده و در داخل محيط کشت 37 درجه سانتي گراد از قبل به تعادل رسيده، قرار داده شد. با استفاده از تکنيک Dissecting تخمکها را خارج نموده و بعد از شستشو با mR1ECM ، تخمکها را به قطرات محيط کشت mR1ECM منتقل کرده و سپس اسپرمهاي متحرک به توانايي رسيده به تعداد يک ميليون به ازاي هرميلي ليتر محيط کشت به آن اضافه شد. عمل لقاح 8-6 ساعت بعد از اضافه کردن اسپرم با مشاهده دو پيش هسته مشخص ميشود و بدين ترتيب زيگوت بدست آمده و تخمک هاي بارور شده (زيگوت) بعد از دنود (لخت) و شستشو به محيط کشت تازه از قبل به تعادل رسيده در گروه هاي مختلف مورد مطالعه منتقل شده و به مدت 5 روز کشت داده شدند.
نمايي از ظرف کشت و لقاح
14-2) ارزيابي رشد جنينها:
براي ارزيابي مراحل رشد زيگوت مواد مذکور در زير ميکروسکوپ معکوس مورد ارزيابي قرار گرفت، بررسي ميزان کليواژ 24 ساعت بعد از کشت صورت گرفته و در زيگوتهاي موجود در هر گروه، جنينها از نظر فراگمانتاسيون و ميزان، طي مراحل رشد جنيني يا تعداد جنينهاي متوقف شده و تيپبندي جنينهاي متوقف شده با توجه به فاکتورهاي مختلفي نظير ليزشدن جنينها و نکروتيک بودن آنها و فراگمانتاسيون مقايسه گرديدند.
تيپ بندي زيگوتهاي متوقف شده به شرح ذيل ميباشد:
تيپ1 : جنينهاي باليز، فراگمانته شدن و نکروتيک بودن کامل
تيپ2 : جنين هاي باليز و فراگمانته شدن در تعدادي از بلاستومرها
تيپ3 : جنين هاي با تعداد کمي بلاستومرهاي ليز و فراگمانته
کيفيت جنينها و تعداد جنينهاي رشد کرده در طي 120 ساعت و درصد شکافتگي وميزان جنينهاي متوقف شده و درصد بلاستوسيستهاي ايجاد شده در هر گروه مورد ارزيابي قرار گرفت.
15-2) ارزيابي اسپرماتوژنز در بافت بيضه
براي اين منظور تعداد 100 لوله مني ساز در هر بيضه جهت ارزيابي شاخصهاي زير قرار گرفتند.
ضريب تمايز لولهاي :(TDI) جهت مشخص نمودن اين شاخص، درصد لولههاي منيسازي که داراي سه و يا بيشتر از سه رده سلولهاي اسپرماتوژنز تمايز يافته از سلولهاي اسپرماتوگوني A بودند محاسبه گرديد ( Rezvanfar et al., 2008).
ضريب بازسازي(RI): درصد لولههاي مني سازي که در آنها سلولهاي زايا به رده اسپرماتوگوني بينابيني يا ردههاي پس از آن رسيده بودند جهت ارزيابي اين شاخص محاسبه گرديد (يا نسبت اسپرماتوگونيهاي B به اسپرماتوگونيهاي A)
( Meistrich and van Beek, 1993).
ضريب سلول سرتولي (SCI) و ضريب ميوزي (MI): به منظور محاسبه ضريب سلول سرتولي و ضريب ميوزي به ترتيب نسبت تعداد سلولهاي زايا به تعداد سلولهاي سرتولي (Russell et al., 1990) و نسبت تعداد اسپرماتيدهاي گرد به اسپرماتوسيت هاي اوليه مشخص گرديد (Kheradmand et al,. 2011)
16-2) ارزيابي خصوصيات اسپرمها
1-16-2) نحوه استحصال اسپرم از اپيديدم
به منظور ارزيابي خصوصيات اسپرم ابتدا اپيديديم موشها زير لوپ با بزرگنمايي 20 برابر از بافت بيضه جدا شده وبافتهاي اطراف آن تميز گرديد. بلافاصله دماپيديديم درون پتري ديشهاي حاوي يک ميلي ليتر محيط کشت mR1ECM در هر ميليليتر که امروزه به عنوان محيط کشت مناسب براي اسپرمها در نظر گرفته شده است، قرار گرفت . براي جلوگيري از ايجاد شوک حرارتي و آسيب به اسپرمها، تمام وسايل مورد استفاده و محيط کشت قبل از مصرف در انکوباتور 37 درجه قرار داده شدند. سپس دم اپي ديديم در داخل محيط کشت به قطعات کوچک خرد شده و به مدت30 دقيقه در درون محيط کشت در انکوباتور باقيماند تا امکان خروج اسپرمها از اپيديديم فراهم آيد.
2-16-2) بررسي تحرک در اسپرماتوزوئيدها
بعد از خارج کردن اپيديديمها، دم آنها را در داخل ml ? محيط کشت mR1ECM ،C ??° قرار داده شد و سپس با ايجاد دو برش عرضي و طولي، به مدت ?? دقيقه درون انکوباتور CO2 قرار داده شد. سپس از انکوباتور خارج و قطعات اپيديديم از محلول بيرون آورده و با ml ? محيط کشت شستشو داده شد. سپس يک قطره از سوسپانسيون تهيه شده را بعد از رقيق کردن در محيط کشت مذکور بر روي لام قرار داده و شمارش درصد اسپرمهاي متحرک با پيشرونده، سريع، متوسط ، کند و غيرمتحرک در چند ميدان ديد و در سه مرحله با استفاده از ميکروسکوپ صورت گرفت و درصد اسپرمهاي متحرک بدست آمد (Selvakumar et al., 2006) .
3-16-2) شمارش اسپرمها :
به منظور شمارش تعداد اسپرمها از لامهاي معمولي استفاده شد. ?? ميکروليتر از محلول رقيق شده اسپرم بر روي لام معمولي قرار گرفته و تعداد اسپرمها در هر ميليليتر با استفاده از فرمولd ×????? n ×و توسط ميکروسکوپ نوري با درشت نمايي ??? برابر محاسبه گرديد که n تعداد اسپرمهاي شمارش شده و d عکس رقت سوسپانسيون حاوي اسپرم ميباشد (Zambrano et al., 2005).
17-2) ارزيابي قابليت زنده ماندن و مورفولوژي اسپرمها
براي ارزيابي درصد اسپرمهاي مرده ونيز اسپرمهاي غيرطبيعي از لحاظ مورفولوژيکي رنگآميزي ائوزين نگروزين مورد استفاده قرار گرفت. مبناي تشخيص اسپرمهاي مرده در اين روش رنگآميزي بر اين اصل استوار است که در اثر آسيب به غشاء پلاسمايي، اسپرمها در برابر رنگ مذکور نفوذپذير ميگردند. لذا آن دسته از اسپرمهايي که هر يک از قطعات سر، گردن و يا دم آنها رنگ گرفته بود به عنوان اسپرمهاي مرده در نظر گرفته شدند. در همين راستا اسپرمهايي که داراي بقاياي سيتوپلاسمي و نيز ساير اختلالات مورفولوژيک بودند، به عنوان اسپرمهاي غيرطبيعي در نظر گرفته ميشدند. تعداد ??? اسپرم براي هر نمونه با درشتنمايي ??? برابر مورد بررسي قرار گرفت و نتايج حاصل در قالب درصد بيان شدند (Wyrobek et al., 1983).
?8-2) بررسي وضعيت بلوغ هسته اسپرم: رنگ آميزي آنيلين بلو (AB)
پروتئين هيستون داراي تعداد زيادي اسيدآمينه ليزين ميباشد که با رنگهاي اسيدي مانند آنيلين بلو واکنش ميدهد و آبي رنگ ميشود. بنابراين اسپرمهايي که پس از تراکم در کروماتين خود، داراي هيستونهاي اضافي باشند با اين رنگ آميزي مشخص ميشوند. پس از تهيه اسمير از هر نمونه حيواني و خشک شدن در هوا، مرحله فيکس شدن نمونهها توسط فيکساتيو گلوتارآلدئيد ?% در بافر به مدت ?? دقيقه انجام شد. در مرحله بعد نمونهها توسط محلول ?% آنيلين بلو در اسيد استيک ?% (?/?=PH) به مدت ? دقيقه رنگ آميزي شدند. پس از شستشو با آب مقطر، لامها با ميکروسکوپ نوري و عدسي 100× مورد بررسي قرار داده و با شمارش ??? اسپرم، درصد اسپرم بيرنگ (نابالغ) تعيين گرديد. (Hamadeh et al., 2001)
19-2) بررسي DNA شکسته و يا تک رشتهاي: رنگ آميزي آکريدين اورانژ (AO)
اين رنگ فلورسنت، جهت تمايز DNA دورشتهاي سالم از DNA تک رشتهاي ناسالم و دناتوره بکار ميرود. AO با DNA دو رشتهاي سالم زير ميکروسکوپ فلورسنت سبزرنگ و با DNA تک رشتهاي دناتوره زرد تا قرمز رنگ ميشود. پس از تهيه اسمير از هرنمونه و خشک کردن در هوا، فيکس شدن نمونهها توسط محلول کارنوي به مدت حداقل 2ساعت صورت گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت 19/0 ميلي گرم در بافر سيترات فسفات به مدت 10 دقيقه براي رنگآميزي لامها بکار رفت. پس از شستشو توسط آب جاري، لامها توسط ميکروسکوپ فلورسنت و در يک محيط تاريک با فيلتر nm460 بررسي شدند (Erenpreiss et al., 2001).
20-2) مطالعات هيستوشيميايي بيضه
1-20-2) رنگ آميزي پريوديک اسيد شيف (PAS)
جهت مشخص نمودن کربوهيدراتها در بافت بيضه، مقاطع بافتي تهيه شده از قالبهاي پارافيني با استفاده از اين روشرنگ آميزي شدند. روش رنگآميزي PAS به طور معمول جهت مطالعه پليساکاريدها، ترکيبات موکوسي خنثي و غشاهاي پايه مورد استفاده قرار ميگيرد. اين ترکيبات متعاقب رنگ آميزي به واسطه واکنش شيف رنگ قرمز ارغواني به خود ميگيرند (Lee and Luna, 1968).
2-20-2)رنگ آميزي سودان بلک
به منظور مطالعه چربيها در بافت بيضه، برش انجمادي تهيه شده توسط دستگاه کرايواستات با استفاده از اين روش رنگ آميزي شدند. روشهاي رنگ آميزي سودان- ب جهت مشخص نمودن ذخاير اگزوژن و اندروژن بسياري از چربيها نظير فسفوليپيدها، چربيهاي خنثي و استرولها مورد استفاده قرار گرفته و به ترتيب چربيها را با رنگهاي سياه و قرمز مشخص مينمايند(Sheehan and Storey, 1947) .
3-20-2) بررسي هيستوشيميايي فعاليت آنزيم الکالين فسفاتاز
الکالين فسفاتاز يک آنزيم هيدرولاز است که مسئول حذف گروههاي فسفات از انواع متعددي از مولکولها نظير نوکلئوتيدها، پروتئينها و الکالوئيدها ميباشد. اين روش در ارزيابي ميزان واکنشهاي التهابي در بافتهاي مختلف مورد استفاده قرار ميگيرد و اساس آن بر پايه توليد رنگ قهوهاي تيره توسط فسفات کلسيم آزاد شده به واسطه واکنش آنزيمي در حضور نيترات کبالت و سولفيد آمونيوم ميباشد. از آنجا که فرايند ثبوت و پاساژ بافتي موجب آسيب به اين آنزيم ميگردد مطالعه فعاليت آنزيم الکالين فسفاتاز بر روي برشهاي انجمادي تهيه شده از نمونههاي بافتي تازه صورت پذيرفت (Bakst et al., 2007) .
21-2) آناليز و تحليل دادهها
محاسبه آماري با استفاده از نرم افزار آماري SPSS نسخه 16 انجام شد و براي مقايسه ميانگين بين گروهها از آناليز واريانس يک طرفه و تست تعقيبي Tukey استفاده شد (p<0.05) به عنوان معيار معني دار بودن اختلاف ها در نظر گرفته شد.
*فصل سوم
نتايج و يافتهها
علائم اختصاري بکار برده شده در نمودارهاي مربوط به گروه هاي تحت تيمار
Con: گروه کنترل، Cyc25: گروه سيکلوسپورين روز 25، Cyc45 : گروه سيکلوسپورين روز 45 ، Cyc+GSE25 : گروه سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور روز 25، GSE45+Cyc : گروه سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور روز 45،Cyc+ HE25: گروه سيکلوسپورين+ عصاره زالزالک روز 25،: Cyc+ HE45 گروه سيکلوسپورين + عصاره زالزالک روز 45
1-3) نتايج حاصل از پارامترهاي مختلف اسپرم
1-1-3) نتايج حاصل از شمارش اسپرم در اپيديديم
طبق نمودار( 1-3 ) تعداد اسپرمهاي اپيديديمي در گروههاي تحت تيمار با سيکلوسپورينآ در روزهاي 25 و 45 به طور معني داري در سطح p<0.05 نسبت به گروه کنترل کاهش يافت. در گروههايي که عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را بمدت 25 روز دريافت کردند تعداد اسپرمهاي ايجاد شده تا حدي بهبود حاصل کرد به طوري که داراي تفاوت معنيدار با گروهي که بمدت 45 روز سيکلوسپورينآ را دريافت کردند بود ولي با گروه سيکلوسپورين 25 اختلاف آماري معنيداري نداشتند. در گروههاي عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور روز 45 روند بهبود تا حدي پيشرفت کرد که در پايان روز 45 تفاوت معنيداري در سطح p<0.05 بين اين دو گروه با گروه کنترل نبود.
نمودار1-3: مقايسه ميانگين تعداد اسپرم در گروه هاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
2-1-3) نتايج حاصل از مطالعه ميزان اسپرم زنده
طبق نمودار(2-3) درصد اسپرمهاي زنده در گروه تيمار شده با سيکلوسپورينآ نسبت به گروه کنترل کاهش يافته اما اين کاهش در سطح p<0.05 معنيدار نبوده و با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور همراه با سيکلوسپورينآ ، همين مقدار کاهش نيز بهبود يافته است و در روز 45 هيچ گونه اختلاف معنيداري بين گروه دريافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور با گروه کنترل در سطح p<0.05 مشاهده نشد(P>0.05).
نمودار2-3: مقايسه ميانگين درصد اسپرمهاي زنده در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
3-1-3) نتايج حاصل از شمارش اسپرمهاي نابالغ
طبق نمودار(3-3) درصد اسپرمهاي نابالغ در گروهي که بمدت 45 روز سيکلوسپورينآ دريافت کرده، نسبت به ساير گروهها داراي اختلاف معنيداري در سطح p<0.05 با گروه کنترل ميباشد. با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور به عنوان آنتي اکسيدان درصد توليد اسپرمهاي نابالغ کاهش يافت ، به طوري که گروههاي دريافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور در روز 25و 45 اختلاف معنيداري در سطح p<0.05 با گروه کنترل ندارند (P>0.05).
نمودار3-3: مقايسه ميانگين درصد اسپرمهاي نابالغ در گروههاي تحت تيمار
* نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
4-1-3) نتايج حاصل از مطالعه کروماتين اسپرم
طبق نمودار (4-3) درصد اسپرمهاي با کروماتين آسيبديده در گروهي که سيکلوسپورين آ را بمدت 25 روز دريافت کرده است افزايش يافته اما ميزان افزايش نسبت به گروه کنترل در سطح p<0.05 معنيدار نميباشد اما در گروه سيکلوسپورينآ روز 45 درصد اسپرمهاي با کروماتين آسيبديده به طور معنيداري در سطح p<0.05نسبت به گروه کنترل افزايش يافته است. با مصرف همزمان عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور با داروي سيکلوسپورينآ اين درصد کاهش يافته و در نهايت با گروه کنترل داراي اختلاف معنيداري در سطح p<0.05 نميباشد(P>0.05).
نمودار4-3: مقايسه ميانگين درصد اسپرمهاي با کروماتين آسيب ديده در گروههاي تحت تيمار
* نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
تصوير 1-3) اسپرمهاي رت رنگ آميزي شده با روش ائوزين نگروزين جهت ارزيابي قابليت زنده ماندن اسپرم، اسپرمهاي زنده (بي رنگ) و اسپرمهاي مرده (رنگ گرفته)
تصوير2-3) اسپرمهاي با مورفولوژي طبيعي رت رنگآميزي شده با روش رنگ آميزي هماتوکسيلين براي ارزيابي مورفولوژي اسپرم
2-3) نتايج حاصل از مطالعه پارامترهاي مختلف لقاح (IVF)
1-2-3) نتايج حاصل از تعداد اووسيتهاي لقاح يافته در گروههاي مختلف آزمايش
طبق نمودار (9-3) به دنبال تجويز سيکلوسپورينآ تعداد اووسيتهاي لقاح يافته در گروههاي تحت تيمار که سيکلوسپورين آ را به مدت 25 و 45 روز دريافت کردند کاهش معنيداري را در سطح p<0.05 نسبت به گروه کنترل نشان ميدهند. در گروههايي که علاوه بر سيکلوسپورين، عصاره هسته انگور را دريافت کردند، در تعداد اووسيتهاي لقاح يافته بهبود حاصل شد به طوري که در روزهاي 25و45 اختلاف معنيداري بين اين دو گروه و گروه کنترل در سطح p<0.05 وجود نداشت. اما گروهي که علاوه بر سيکلوسپورين، عصاره زالزالک را دريافت کرد بهبودي به ميزان کمتري حاصل شد به طوري که در روزهاي 25و 45 اختلاف معني داري بين اين گروه و گروه کنترل در سطح p<0.05 مشاهده شد.
نمودار9-3: مقايسه ميانگين درصد اووسيتهاي لقاح يافته در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
2-2-3) نتايج حاصل از تعداد جنينهاي دوسلولي
طبق نمودار(10-3) تعداد جنين 2 سلولي در گروه کنترل داراي تفاوت معنيدار با گروههاي تيمار شده با سيکلوسپورينآ در سطح p<0.05 ميباشد. به طوري که در گروههاي تحت تيمار تا حد زيادي درصد جنينهاي دو سلولي کاهش پيدا کرده است. در گروههايي که علاوه بر سيکلوسپورين عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک را دريافت کردند روند بهبود بخشي حاصل شد، به طوري که در پايان روز 45 اين گروها اختلاف معنيداري با گروه سيکلوسپورين روز 45 در سطح p<0.05 داشته و با گروه کنترل و سيکلوسپورين روز 25 هيچ گونه اختلاف آماري معنيداري در سطح p<0.05 نداشتهاند(P>0.05).
.
نمودار 10-3: مقايسه ميانگين درصد جنينهاي دوسلولي در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است
3-2-3) نتايج حاصل از تعداد بلاستوسيست
طبق نمودار (11-3 ) تعداد بلاستوسيستها در گروههاي تحت تيمار با سيکلوسپورين در روزهاي 25 و 45 داراي اختلاف معنيداري با گروه کنترل در سطح p<0.05 است به طوري که در اين گروهها درصد بلاستوسيستها تا حد زيادي کاهش يافته است. در گروههاي تحت تيمار که همراه با سيکلوسپورينآ عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را دريافت کردند ، اين پارامتر بهبود يافت به طوري که اين گروهها داراي اختلاف معنيداري با گروه سيکلوسپورين ميباشند ، درحالي که هيچ گونه اختلاف آماري معني داري با گروه کنترل در سطح p<0.05 ندارند(P>0.05).
نمودار 11-3: مقايسه ميانگين درصد بلاستوسيستها در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
4-2-3) نتايج حاصل از تعداد جنينهاي ارست شده
طبق نمودار( 12-3 ) درصد جنين ارست شده در گروهي که به مدت 25 روز داروي سيکلوسپورين را دريافت کرده است داراي تفاوت معنيداري با گروه کنترل در سطح p<0.05 نميباشد. اما با ادامه تيمار، درصد جنينهاي ارست شده در گروه سيکلوسپورين روز 45 اختلاف معنيداري در سطح p<0.05با گروه کنترل نشان ميدهند. همچنين درگروههاي سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور ، در روزهاي 25 و 45 اختلاف معنيداري در درصد جنينهاي ارست شده با گروه کنترل مشاهده نشد. و در گروه سيکلوسپورين + عصاره زالزالک در روز 25 تعداد جنينهاي ارست شده نسبت به گروه کنترل افزايش قابل ملاحظه اي را نشان داد اما با ادامه تيمار در روز 45 درصد جنين هاي ارست شده کاهش يافت طوري که اختلاف معنيداري در سطح p<0.05 بين اين گروه وگروه کنترل مشاهده نشد (P>0.05).
.
نمودار12-3: مقايسه ميانگين درصد جنينهاي ارست شده در گروههاي تحت تيمار
* نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
5-2-3) نتايج حاصل از تعداد جنينهاي تيپ 1
طبق نمودار( 13-3 ) درصد جنين تيپ 1 (جنينهايي با کيفيت بد) در گروهي که به مدت 25 روز داروي سيکلوسپورين را دريافت کردهاست داراي تفاوت معنيداري با گروه کنترل نميباشد. اما با ادامه تيمار در گروههايي که سيکلوسپورين را به مدت 45 روز دريافت کردهاند به طور قابل ملاحظهاي افزايش يافت و داراي تفاوت معنيدار با گروه کنترل در سطح p<0.05 ميباشند . در گروههايي که علاوه بر سيکلوسپورين عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را دريافت کرده اند در روز 25 به مقدار کمي بهبودي حاصل شد، طوري که بين گروههاي روز 25 و کنترل اختلاف معنيدار در سطح p<0.05 مشاهده شد. اما با ادامه تيمار با عصاره هسته انگور و زالزالک در روز 45 بهبودي زياد حاصل شد و بين گروههاي روز 45 و کنترل اختلاف معنيداري در سطح p<0.05 وجود نداشت(P>0.05).
نمودار13-3: مقايسه ميانگين درصد جنينهاي تيپ 1 در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
6-2-3) نتايج حاصل از جنينهاي تيپ 2
طبق نمودار (14-3) درصد جنينهاي تيپ2 (جنين هايي با کيفيت متوسط) در گروهي که سيکلوسپورين آ را دريافت کرده است (روزهاي 25 و 45) افزايش يافته است ، به طوري که داراي تفاوت معنيدار با گروه کنترل در سطح p<0.05 مي باشند. با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور تعداد جنينها کاهش مييابد و در روز 25 و 45 داراي اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 با گروه کنترل نميباشند(P>0.05).
نمودار14-3 : مقايسه ميانگين درصد جنينهاي تيپ 2 در گروههاي تحت تيمار
* نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
6-2-3) تنايج حاصل از تعداد جنينهاي تيپ 3
طبق نمودار (15-3) گروههايي که سيکلوسپورينآ را به مدت 25 و 45 روز دريافت کردند کاهش معنيداري در درصد جنينهاي تيپ 3 (جنينهاي با کيفيت خوب) را نشان دادهاند و با گروه کنترل داراي اختلاف آماري معنيداري در سطح p<0.05 ميباشند. استفاده از عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک باعث بروز روند بهبود بخش در اين نوع جنينها شده به طوري که در روز 45 هيچ گونه اختلاف آماري معنيداري در سطح p<0.05 بين گروه هاي سيکلوسپورين + زالزالک و سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور روز 45 با گروه کنترل وجود نداشت(P>0.05).
نمودار15-3: مقايسه جنينهاي تيپ 3 در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
تصوير 3-3) اووسيت به همراه توده کومولوسي در پيرامون آن (Coc41) جهت انجام پروسه IVF
تصوير4-3) جنين 2 سلولي(200×)
تصوير 5-3) جنين در مراحل مختلف تقسيم(400×).a : جنين در مرحله چهار سلولي، b : جنين در مرحله مورولا
c : جنين در مرحله بلاستوسيست، d : گامت هاي لقاح نيافته
تصوير 6-3) جنينهايي با کيفيت عالي(400×)
4-3) نتايج بخش هيستوشيميايي
در تحقيق حاضر در گروه كنترل ساختار بافتي بيضه، مجاري منيساز و اپيتليوم زاياي آن كاملاً منظم و طبيعي بود و تغييرات آتروفيك و دژنراتيو چنداني مشاهده نگرديد. در گروه سيکلوسپورينآ ساختار بافتي و سلولي بيضه دچار بي نظمي و تغييرات دژنراتيو گسترده شده بود و تغييراتي شامل آتروفي و بهم ريختگي مجاري منيساز، بينظمي در غشاء پايه مجاري همراه با جدا شدگي سلولهاي اسپرماتوگوني از آن قابل مشاهده بود . هم چنين در اپيتليوم منيساز با وجود ظاهر مطبق، طبقات سلولي داراي آرايشي نامنظم بوده و در بعضي از مجاري تودههاي هياليني حاوي هستههاي متعدد و كوچك در لومن قابل مشاهده بود. سلول هاي سرتولي نيز در اپيتليوم زايا به تعداد كم تر و اكثراً با موقعيت قاعدهاي و نزديك غشاء پايه قابل تشخيص بودند. گاهي مجاري منيساز در حيوانات تحت درمان با سيكلوسپورينآ فاقد لومن مركزي بودند كه احتمالاً به دليل غير فعال شدن سلولهاي سرتولي مي باشد. بافت هم بند بينابيني بيضه در گروه تحت درمان با سيکلوسپورينآ تقريباً همانند گروههاي ديگر حاوي تمام اجزاء و سلولها بود ولي از تراكم و يك نواختي آنها كاسته شده و حالت فيبروز و ادم قابل مشاهده بود. كپسول بيضه (تونيكا آلبوژينه آ) در اين گروه ظاهري شبيه گروههاي كنترل داشته ولي افزايشي در تراكم رشت هاي كلاژن نسبت به سلولها قابل مشاهده بود. بافت بيضه حيوانات گروههاي دريافتکننده عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک از لحاظ ساختار هيستومورفولوژيكي تا حدود زيادي شبيه گروههاي كنترل بود. بررسيهاي بافتشناسي بيضه حيوانات در گروه تحت درمان با سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور و سيکلوسپورين + عصاره زالزالک نشان داد كه اكثر تغييرات تخريبي و بينظميهاي ايجاد شده توسط داروي سيکلوسپورينآ با تجويز عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک برگشت و تعديل يافته بود. به طوري كه مجاري منيساز نمايي طبيعي داشته و اپي تليوم زايا نيز تا حدود زيادي سازمان يافتگي و حالت مطبق خود را بازيافته بود و بهم ريختگي كاهش يافته بود. غشاء پايه نيز تقريباً به وضعيت طبيعي خود نزديك شده بود. بافت هم بند بينابيني بيضه نيز درگروه تحت درمان با سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور و سيکلوسپورين + عصاره زالزالک از لحاظ ساختار شبيه گروههاي كنترل بوده و سلولها، رشتهها و عروق خوني از يك تراكم و نظم نسبتاً طبيعي برخوردار بودند.
1-4-3) نتايج مربوط به رنگ آميزي PAS:
اين رنگ آميزي جهت مشخص نمودن ذخاير کربوهيدراتها در رده سلولهاي اسپرماتوژنز صورت گرفته است، نتايج حاصله مشخص کرد که ميزان ذخاير کربوهيدراتها در گروههاي دريافت کننده سيکلوسپورين روزهاي 25 و 45 در رديفهاي اوليه سلولهاي اسپرم ساز کاهش يافته و اين کاهش در روز 45 بخصوص در لوله هاي اسپرمساز آسيب ديده و نزديک به کپسول بيضه بسيار مشهود ميباشد. اما در گروه سيکلوسپورين + هسته انگور يک افزايش در ذخاير کربوهيدرات در ردههاي اوليه سلولهاي اسپرماتوژنز (3 الي 4 رديف اول رده اسپرماتوژنز) ديده ميشود. همچنين در گروه دريافتکننده عصاره زالزالک نيز ذخاير کربوهيدراتي افزايش در رديف هاي اول رده اسپرماتوژنز را نشان ميدهند اما مطالعات ما مشخص نمود که اين افزايش در ذخاير کربوهيدراتي در گروه دريافت کننده عصاره هسته انگور بخصوص در روز 45 افزايش چشمگيري را نشان ميدهد. اما در اين مطالعه مشخص گرديد که در لولههاي اسپرماتوژنز در 3 الي 4 رديف به بعد ذخاير کربوهيدراتي در گروه رتهاي دريافت کننده سيکلوسپورين افزايش يافته و اين ذخاير در گروه سيکلوسپورين+ عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور کاهش يافته است.
تصوير 7-3 ) رنگ آميزي PAS : تصويرراست گروه سيکلوسپورين -عصاره هسته انگور روز 45
تصوير وسط گروه کنترل، تصويرچپ گروه سيکلوسپورين روز 45
2-4-3) نتايج مربوط به رنگ آميزي Sudan Black :
در بررسيهاي ما مشخص شد که در گروه سيکلوسپورين روزهاي 25 و45 در رديفهاي اول ذخاير چربي در سلولهاي رده اسپرماتوژنز نسبت به نسبت به گروه کنترل بالا رفته است و اين افزايش در روز 45 بيشتر از روز 25 ميباشد. بخصوص نتايج حاصله مشخص کرد که اين افزايش در ذخاير چربي در لولههاي اسپرم ساز نزديک به کپسول بيضه مشهودتر ميباشد. اما در گروههاي سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور و سيکلوسپورين + عصاره زالزالک ميزان ذخاير چربي در رديفهاي اول نسبت به گروه سيکلوسپورين کاهش يافته و در رديفهاي بالاتر (اسپرماتوسيت اوليه به بعد) بالا رفته است. در گروه سيکلوسپورين+ عصاره هسته انگور افزايش ذخائر چربي در رديف هاي بالاتر افزايش چشمگيري داشته است. بنابراين نتايج هيستوشيميايي نشان ميدهد که اين دارو که به عنوان يک داروي تضعيفکننده سيستم ايمني است ميتواند يک سري تغييرات متابوليکي در لولههاي اسپرمساز ايجاد نمايد که عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور تا حدود زيادي اثر محافظتي در جلوگيري از تغييرات متابوليکي اين لولههاي اسپرمساز دارد.
تصوير 8 -3) رنگ آميزي Sudan black : تصويرراست گروه سيکلوسپورين – عصاره هسته انگور روز 45
تصوير وسط گروه کنترل، تصويرچپ گروه سيکلوسپورين روز 45
3-4-3) بررسي آلکالين فسفاتاز بافتي:
اين آنزيم در بافتها و سلولهاي آسيب ديده توليد شده و افزايش پيدا ميکند. در مطالعه ما مشخص گرديد که ميزان اندکي از اين آنزيم در سلولهاي رده اسپرماتوژنز در لولههاي سمينيفر گروه کنترل وجود دارد که در گروه سيکلوسپورين روز 25 و 45 افزايش چشمگيري در ميزان آلکالين فسفاتاز بافتي در تمامي ردههاي سلولهاي اسپرماتوژنز ديده ميشود اما يک کاهش جزئي در گروههاي تحت درمان با عصارههاي زالزالک و عصاره هسته انگور ديده ميشود اما اين کاهش در حد گروه کنترل نيست و اين نشان دهنده اثر محافظتي متوسطي از عصارههاي مذکور بوده ولي مطالعات بعدي و طولاني مدت در زمانهاي بيشتر از 45 روز جهت بررسي دقيق اين آنزيم در ردههاي سلولهاي اسپرماتوژنز لازم و ضروري است که آيا ميزان آنزيم در طولاني مدت در گروههاي تحت درمان با عصارههاي مذکور چه تغييراتي پيدا خواهد کرد.
شکل 9 -3) رنگ آميزي آلکالين فسفاتاز : تصويرA گروه کنترل ، تصوير B گروه سيکلوسپورين- عصاره هسته انگور روز 45 ، تصويرC گروه سيکلوسپورين روز 45 ، تصويرD دو لوله اسپرم ساز TDI negativ
5-3) نتايج حاصل از هيستومورفومتري بيضه
1-5-3) نتايج حاصل از اندازه گيري قطرلولههاي سمينيفر(STsD) و ضخامت اپي تليوم لولههاي سمينيفر(GEH)
طبق نمودارهاي (16-3) و(17-3) ميانگين مقادير قطر مجاري منيساز و ضخامت اپيتليوم مجاري منيساز در گروه سيکلوسپورين كاهش معني داري نسبت به گروه کنترل پيدا كرده است (p<0.05). درمان با عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک تا حد زيادي از كاهش قطر لولههاي سمينيفر جلوگيري كرد اما در پايان روز 45 هنوز بين گروههاي دريافت کننده دريافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگورنسبت به گروه کنترل اختلاف آماري معنيداري در سطح p<0.05 وجود داشت. همچنين ضخامت اپيتليوم در گروههاي دريافت کننده عصاره هسته انگور در روز 45 با گروه کنترل در سطح p<0.05 اختلاف آماري معنيداري مشاهده نشد، اما بين گروه دريافت کننده عصاره زالزالک و کنترل همچنان اختلاف آماري معنيدار وجود داشت.
نمودار16-3: مقايسه ميانگين قطر لولههاي مني ساز در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
نمودار17-3: مقايسه ميانگين ضخامت اپيتليوم مجاري منيساز در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
2-5-3) نتايج حاصل از اندازه گيري تعداد سلول هاي ليديگ بيضه(LCN)
طبق نمودار( 18-3) ميانگين تعداد سلول هاي ليديگ بيضه در گروه سيکلوسپورينآ (روز هاي 25و 45) نسبت گروه كنترل كاهش معنيداري در سطح p<0.05 پيدا ميکند. در صورتي که در گروههاي تحت درمان هم زمان با سيكلوسپورينآ و عصاره هسته انگور از لحاظ آماري تفاوت معني داري در پارامترهاي فوق با گروه كنترل مشاهده نگرديد(P>0.05). اين پارامتر در گروه دريافت کننده عصاره زالزالک همراه با داروي سيکلوسپورين نسبت به گروه کنترل افزايش معنيداري پيدا نکرده و از لحاظ آماري(p<0.05 ) بين آنها تفاوت معنيدار وجود دارد.
نمودار18-3: مقايسه ميانگين تعداد سلولهاي ليديگ در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
3-5-3) نتايج حاصل از اندازهگيري تعداد سلولهاي لنفاوي تکهستهاي
طبق نمودار (19-3) در گروههاي تيمار شده با سيکلوسپورينآ در روزهاي 25 و 45 تعداد سلولهاي لنفاوي تک هستهاي نسبت به گروه کنترل در سطح p<0.05 کاهش مييابد. با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هستهانگور اين پارامتر بهبود يافت طوري که در روزهاي 25 و 45 بين گروه هايي که همراه با سيکلوسپورين عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را دريافت کردند با گروه کنترل اختلاف آماري معنيداري مشاهده نشد(P>0.05).
نمودار19-3: مقايسه ميانگين تعداد سلولهاي لنفاوي تکهستهاي در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
6-3) نتايج حاصل از ارزيابي هاي اسپرماتوژنز در بافت بيضه
بررسيهاي آماري جهت مقايسه شاخصهاي اسپرماتوژنز در گروههاي مختلف آزمايشي آشکار ساخت که تجويز داروي سيکلوسپورينآ منجر به حذف سلولهاي زايا در روند اسپرماتوژنز ميگردد که اين امر کاهش معنيداري (p<0.05) را در ضريب تمايز لولهاي، ضريب بازسازي لولههاي منيساز، ضريب ميوزي و ضريب سلول سرتولي در مقايسه با گروه کنترل در پيدارد.
1-6-3) نتايج حاصل ازاندازه گيري ضريب ميوزي (MI) و ضريب بازسازي (RI)
طبق نمودارهاي (21-3) و (20-3) ضريب ميوزي و ضريب بازسازي در گروههاي دريافت کننده سيکلوسپورين نسبت به گروه کنترل کاهش معنيداري را در سطح p<0.05 نشان ميدهند. ضريب ميوزي در گروههاي دريافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور، تنها در روز 45 هيچ گونه اختلاف آماري معنيداري با کنترل نشان نداد(P>0.05). ضريب بازسازي در گروههايي که علاوه بر سيکلوسپورينآ، عصاره زالزالک را دريافت کردند(روز 45) نسبت به گروههاي سيکلوسپورينآ افزايش و در مقايسه با گروه کنترل داراي اختلاف آماري معنيداري نبود (p<0.05) و در گروههايي که عصاره هسته انگور(روز 45) دريافت کردند تاحدي بهبود يافت و داراي اختلاف آماري معنيدار با گروه کنترل نميباشند(P>0.05).
نمودار20-3: مقايسه ميانگين درصد ضريب بازسازي در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
نمودار21-3: مقايسه ميانگين درصد ضريب ميوزي در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
2-6-3)نتايج حاصل ازاندازه گيري ضريب تمايز لولهاي(TDI)
طبق نمودار(22-3) ضريب تمايز لولهاي در گروه CsA (روزهاي 25و 45) در مقايسه با گروه كنترل كاهش معنيداري را در سطح p<0.05 نشان ميدهد. تجويز هم زمان عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک با سيكلوسپورينآ از كاهش ضريب تمايز لولهاي جلوگيري كرده و حتي به طور معني داري باعث افزايش آنها در گروههاي روز 45 ميگردد (p<0.05).
نمودار22-3: مقايسه ميانگين ضريب تمايز لولهاي در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p<0.05 است.
3-6-3) نتايج حاصل از اندازه گيري ضريب سلولهاي سرتولي (SCI)
طبق نمودار(23-3) ميانگين ضريب سلولهاي سرتولي در گروه سيکلوسپورينآ (روز هاي 25و 45) نسبت گروه كنترل كاهش معنيداري را در سطح p<0.05 نشان ميدهد. درصورتي که اين پارامتر درگروههاي تحت درمان هم زمان با سيكلوسپورينآ و عصاره هسته انگور نسبت به گروه دريافت کننده سيکلوسپورينآ افزايش يافت و تفاوت معنيداري از لحاظ آماري در سطح p<0.05 بين گروههاي سيکلوسپورين + عصاره هسته انگور و با گروه كنترل مشاهده نشد (P>0.05) ولي اين پارامتردر گروه دريافت کننده عصاره زالزالک همراه با داروي سيکلوسپورين نسبت به گروه کنترل افزايش معنيداري در سطح p0.05 پيدا نکرده و از لحاظ آماري بين آنها تفاوت معنيدار مشاهده شد.
نمودار23-3: مقايسه ضريب سلولهاي سرتولي در گروههاي تحت تيمار
حروف غيريکسان نشان دهنده اختلاف آماري معنيدار در سطح p0.05 است.
فصل چهارم
بحث و نتيجهگيري
در اين مطالعه اثر عصاره هسته انگور سياه و عصاره زالزالک بر روي تغييرات هيستوشيمي بيضه، وتوان باروري (IVF) در موش رت نر که با داروي سانتيمون(سيکلوسپورين) درمان شدهاند بررسي شد.
مواجه شدن اسپرم با مقادير بالاي ROS آسيب به DNA اسپرم را در پي دارد که اين آسيب ميتواند به صورت تغيير در ساختار بازهاي DNA، ايجاد جايگاه هاي بدون باز در DNA، حذف و تغيير چارچوب بازهاي DNA، ايجاد اتصالهاي غير طبيعي بين دو رشته DNA و بازآراييهاي کروموزومي نمود پيدا کند (Kemal Duru et al., 2000). افزايش ميزان ROS همچنين ميتواند موجب اشکال گوناگوني از جهشهاي ژني مانند جهشهاي نقطهاي و چند شکليهاي ژنتيکي گردد که به کاهش کيفيت اسپرم منجر خواهد شد ((Spiropoulos et al., 2002.در مطالعه حاضر نيز مشخص شد که درصد اسپرمهاي با کروماتين آسيب ديده و اسپرم هاي نابالغ در گروههاي تيمار شده با سيکلوسپورين آ نسبت به گروه کنترل افزايش معني داري را در سطحP0.05 نشان داد. اگر ميزان آسيب به DNA اسپرم ناچيز باشد، خود اسپرم و يا حتي اووسيت قادر به ترميم DNA آسيب ديده اسپرم خواهند بود (Agarwal et al., 2007). در صورت گسترده بودن آسيبها، آپوپتوز و قطعه قطعه شدن جنين امري محتمل خواهد بود. کاهش ميزان باروري و کيفيت جنين با ميزان فراواني DNA هاي آسيب ديده ارتباط مستقيم دارد (Sakkas et al., 1998). اسپرم سلولي است که غشاء آن داراي مقادير بالايي از اسيدهاي چرب غير اشباع ميباشد و اسپرمها در طي اسپرميوژنز بخش عمدهاي از سيتوپلاسم خود را که حاوي آنتياکسيدانتها است از دست ميدهد بنابراين اين سلولها نسبت به پراکسيداسيون چربي به وسيله O2 و H2O2 حساسند (Storey, 1997). حضور اسيدهاي چرب غيراشباع با زنجيره بلند در ساختار ليپيدي اسپرم نياز به سيستم آنتياکسيدانتي کارآمد دارد تا در آسيبهاي پراکسيداتيو که در ارتباط با اختلال در عملکرد اسپرم هست محافظت نمايد ((Aitken, 1995.
اسپرم پستانداران به غير از خرگوش ، که اسپرم آن داراي ميزان بالايي کاتالاز است و اسپرم را در برابر H2O2 محافظت ميکند در ساير گونهها داراي ميزان پاييني از کاتالاز است. در شرايط جفتگيري طبيعي اسپرم در معرض شرايط بيهوازي قرار گرفته و در نتيجه آسيبهاي بالقوه راديکالهاي آزاد اکسيژن کاهش مييابد. علاوه بر اين مايعات اويداکت حاوي مقادير بالايي از

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید