به داخل لوله هاي اسپرم ساز انتشار مي‌يابند. اثر قدرتمندي در پيشبرد اسپرماتوژنز دارند.
بنابراين FSH و تستوسترون هر دو براي شروع اسپرماتوژنز لازمند هنگامي كه توليد اسپرم در لوله هاي اسپرم ساز متوقف شود ترشح FSH از هيپوفيزقدامي به ميزان چشمگيري افزايش مي‌يابد. برعكس در صورت توليد بيش از حداسپرم ترشحFSH كاهش مي‌يابد(76).
علت اين اثر فيدبكي منفي بر هيپوفيز قدامي، ترشح هورمون ديگري به نام اينهيبين است. اينهيبين از سلولهاي سرتولي به درون جريان خون آزاد مي‌شود و در جهت مهار ترشحFSH از غده هيپوفيز قدامي عمل مي‌كند. مقدار FSH جريان خون به نوبه خود، توليد اينهيبين را تنظيم مي‌كندكه اين نشان دهنده وجود مكانيسم فيدبك منفي است(34).اينهيبين يكي ازاعضاي سوپرفاميليTGF-?1 از فاكتورهاي رشد است .
از آنجاكه رسپتورهاي TGF_? در بيضه هاي پستانداران بيان مي‌شوند. پيشنهاد مي‌شود، كه اعضاي اين خانواده در اسپرماتوژنز نقش دارند. حداقل يك عضو از اين خانواده بنام پروتئين BMPS2 كه در بين ژرم سل‌ها توليد‌مي‌شود، براي اسپرماتوژنز در موش ضروري است. بررسي‌ها نشان داده است كه BMPS براي ابقاءو حفظ وتکثير ژرم سل ها در دوران بلوغ ضروري است(34).
مواد مورد نياز
كتامين دامي
ديازپام
الكل
پارافين
تولوئن
فيكاستيو فرمالين10%
هماتوكسيلين
ائوزين
سرم فيزيولوژي 9/0 % نمكي( نرمال سالين)
چسب انتلان
الكل اتيليك 96%
لوازم
سرنگ انسولين
سرنگ خونگيريCC 5
سرنگ گاواژ
ميكروتيوب اپندورف
دستكش جراحي
لام نئوبار
پيپت ملانژور
لام و لامل
ظروف شيشه اي مخصوص رنگ آميزي
سمپلر
كوليس
ظروف پتري
لام كراتيكلول
عدسي كراتيكول
لوازم تشريح(پنس، قيچي، اسكالپل و… )
دستگاه ها
دستگاه سانتريفوژ(Hettich Germany)
ميكروسكوپ نوري(Olympus Japan)
ميكروسكوپ دوربين دار(Leica USA)
اسپکتروفوتومتر(Nova)
دستگاه ELISA Reader (Stat Fax )
ترازوي ديجيتال با دقت001/0 گرم(AD Japan)
ترازوي ديجيتال با دقت 01/0 گرم
دستگاه ميکروتوم(Slee Germany)
انتخاب حيوانات آزمايشگاهي
موشهاي صحرايي نر بالغ نژاد ويستار با ميانگين وزني 240-220 گرم از بخش حيوانات انستيتو پاستورآمل تهيه گرديدند. سن حيوانات در هنگام انجام آزمايش يک تا يک ونيم ماه بود.
حيوانات در شرايط كنترل شده از نظر نور(12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريكي) و دماي محيط 24-20 درجه سانتيگراد و رطوبت نسبي 60-40 درصد دراتاق حيوان خانه مرکز آموزش عالي علمي کاربردي رسول اکرم (ص)دامغان نگهداري شدند تا با محيط جديد سازگار شوند. اين شرايط طي آزمايش نيز حفظ گرديد.
دراين مدت جهت تغذيه آنها از غذاي مخصوص موش( غذاي فشرده) و آب آشاميدني شهري در داخل ظروف آبخوري مخصوص استفاده گرديد و حيوانات به آب و غذاي كافي دسترسي داشتند. قفسهاي نگهداري حيوانات هفته اي دوبار ضد عفوني شده و قفسها هر روز شستشو وخرده هاي چوب آن تعويض گرديد.
بعلت ديابت و عوارض ناشي از آن مانند اسهال و پرادراري حيوانات روزانه شستشو داده شدند.
گروه بندي حيوانات
28 سرموش صحرايي نربالغ درچهار گروه زير دسته بندي شدند:
1-گروه كنترل1: شامل 7 سرموش سالم كه فقط به مدت 5 هفته با جيره استاندارد و در شرايط آزمايشگاهي نگهداري شدند .
2-گروه تجربي اول1شامل 7 سرموش كه با تزريق mg/kg 50،STZ ديابتي شده و پس از گذشت دو هفته از ديابتي شدن به مدت 5 هفته در محيط آزمايشگاه نگهداري شدند .
3-گروه تجربي دوم2: شامل 7 سرموش ديابتي كه به مدت 5 هفته، روزانه mg/kg 50،کودز. بصورت گاواج دريافت کردند .
4-گروه تجربي سوم3: :شامل 7 سرموش كه با تزريق mg/kg 50،STZ ديابتي شده و پس از گذشت دو هفته از ديابتي شدن به مدت 5 هفته، روزانه mg/kg 100،کودزو بصورت گاواج دريافت كردند.
القاء ديابت
تعداد 21سراز موشها پس از تزريق درون صفاقي استرپتوزوتوسين (mg/kg 50) محلول در بافر سيترات ديابتي شدند، براي اطمينان 72 ساعت پس ازتزريق STZ، خونگيري از سياهرگ دمي انجام شده قندخون توسط دستگاه Glucocard 0l SENSOR سنجيده شد، موشهايي كه قندخون ناشتاي آنها بالاي 300 بود به عنوان ديابتي در نظر گرفته شدند.
تيمار با دارو
داروي کدزو روزانه متناسب با وزن هر موش با دوز mg/kg 50 و 100،در آب مقطر حل شده به صورت دهاني (گاواج)به حيوان خورانده شد .
خونگيري از حيوانات
از حيوانات در يك نوبت پس از اتمام دوره‌ي آزمايش جهت اندازه گيري فاكتورهاي بيوشيميايي و هورموني خونگيري به عمل آمد. قبل از خونگيري حيوانات با تزريق مواد هوش بري كتامين و ديازپام به صورت درون صفاقي بي هوش شدند. سپس حيوانات بر روي تخته تشريح فيكس شده و خون مستقيماً از قلب آنها گرفته شد.
خون گرفته شده درون لوله آزمايش ريخته شد و در دماي آزمايشگاه قرار گرفت تا تشكيل لخته دهد سپس نمونه ها به مدت 10-5 دقيقه در دستگاه سانتريفوژ با دور3000rpm قرار گرفتند تا سرم آنها جدا شود.
سرم ها توسط سمپلر به لوله هاي اپندورف شماره گذاري شده منتقل گرديد و در فريزر با دماي20-درجه سانتيگراد قرار گرفتند، اندازه گيري سطح هورمون ها و انسولين در دانشگاه علوم پزشکي شاهرود انجام شد
بررسي هاي مورفومتريك
در روز پنجاهم، حيوانات بوسيله تزريق درون صفاقي داورهاي كتامين و ديازپام(با نسبت 80 ميليگرم كتامين و20 ميليگرم ديازپام)بيهوش شده وپس ازتثبيت بر روي تخته جراحي و خونگيري از قلب، شكم آنها باز شد و اندامهاي تناسلي دو طرف شامل بيضه، اپيديديم و وازودفران خارج گرديدند.
درهر نمونه بيضه راست دورن فرمالين 10% جهت آماده سازي براي مطالعات بافتي قرار گرفته و بيضه چپ براي بررسي هاي مورفومتري مورد استفاده قرار گرفت،به اين ترتيب كه،ابتدا توسط ترازوي ديجيتال با دقت001/0 گرم وزن شد. طول وقطر آن بوسيله كوليس اندازه گيري شد، سپس با كمك استوانه مدرج حجم بيضه محاسبه گرديد.
پس ازتهيه مقاطع بافت بيضه كه در ادامه ذكر ميگردد تعداد سلولهاي اسپرماتوگوني، اسپرماتوسيت، اسپرماتيد و سرتولي در زير ميكروسكوپ توسط عدسي شئي 100×به روش ميداني شمارش گرديدند. همچنين قطر توبول سميني فروس و ضخامت غشاء پايه با عدسي شيئي 40× ميكروسكوپ به كمك لام وعدسي كراتيكول اندازه گيري شد.
شمارش اسپرم و بررسي تحرك آن
پس از خارج كردن اپيديديم از بدن حيوان اپيديديم را درون يك پليت حاوي 1 ميلي ليتر سرم فيزيولوژي قرار داده و ابتدا با يك ضربه اسكالپل از وسط به دو نيم شده سپس با فشار پنس اسپرم درون آن به داخل سرم تخليه گرديد.مخلوط توسط هم زدن كاملا
همگن گرديد.
سپس بوسيله سمپلر ازنمونه برداشته وروي
لام جهت بررسي ميزان تحرك قرارگرفت.
بقيه محلول به كمك پيپت ملانژور به
نسبت 200:1 توسط سرم فيزيولوژي
به همراه فيكاستيو رقيق شده و قطره اي از آن روي لام نئوبار قرار گرفت به كمك ميكروسكوپ نوري با عدسي شئي …×تعداد اسپرمها شمارش گرديد.
مراحل آماده سازي بيضه ها جهت تهيه مقاطع بافتي
تثبيت كردن بافت(Fixation)
پس از آنكه بيضه ها از بدن حيوان خارج شد، بلافاصله وارد فرمالين 10% گرديد. اين عمل مانع ازتخريب بافت توسط آنزيمهاي درون سلول ميگردد، بيضه ها تا شروع عمليات بافتي در دماي 4- درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
آب گيري از بافت(Dehydrating)
جهت آبگيري از بافت از الكل اتيليك با غلظت هاي صعودي استفاده شد مراحل آبگيري در جدول زير آورده شده است.
غلظت الكل
زمان
اتانول 35 درجه
اتانول50درجه
اتانول70درجه
اتانول90درجه
اتانول96درجه
اتانول100درجه(1)
اتانول 100درجه(2)
يك ساعت
يك ساعت
يك ساعت
يك ساعت
يك ساعت
نيم ساعت
نيم ساعت
شفاف كردن(clearing)
نمونه بايد از يك حلال غير قطبي عبور داده شود تا الكل كاملا شسسته شده و از بافت بيضه خارج گردد. بدين منظور طي دو مرحله، هر يك به مدت نيم ساعت از تولوئن استفاده ميگردد.
نفوذپارافين(Embedding)
جهت نفوذ پارافين به دورن بافت، نمونه ها درون پارافين مذاب، داخل انكوباتور بادماي 58 درجه سانتيگراد قرار مي گيرند. اين عمل در دو مرحله هر يك به مدت يك ساعت انجام مي شود.
قالب گيري (Blocking)
پارافين جامد را حرارت داده تا به صورت مايع درآيد. سپس آن را درون قالبهاي مخصوص ريخته بافت در وسط آن قرار مي گيرد. پارافين در حالتي كه اطراف نسج را فرا گرفته، به زودي منجمد مي شود.بدين ترتيب بافت مورد نظر در قالبي از پارافين قرار مي گيرد.
مقطع گيري(Sectioning)
ابتدا با يک اسکالپل پارافين هاي اضافي از اطراف بلوک پارافيني برش زده مي شود،تا به شکل ذوزنقه درآيد.سپس بلوک بر روي دستگاه ميکروتوم قرار گرفته وبه ضخامت5 ميکرون برش زده مي شود.برش ها بر روي لام قرار مي گيرند.
رنگ آميزي((Staining
قبل از رنگ آميزي بايد نمونه ها پارافين زدايي شوند.سپس نمونه ها،با عبور از الکل با درجات نزولي،آبدهي مي شوند.براي رنگ آميزي از روش هماتوکسيلين و ائوزين استفاده گرديد.در اين روش هسته چون خاصيت اسيدي دارد،رنگ بازي هماتوکسيلين را پذيرفته وبه رنگ بنفش در مي آيدوسيتوپلاسم به علت خاصيت بازي،رنگ اسيدي ائوزين را به خود گرفته وقرمز رنگ مي شود.مراحل رنگ آميزي در زير آورده شده است.
مرحله
محلول به کار رفته
مدت زمان
پارافين زدايي
تولوئن(1)
تولوئن(2)
5دقيقه
5دقيقه
آبدهي
اتانول 100درجه
اتانول 96درجه
اتانول 90درجه
اتانول 70درجه
اتانول 50درجه
اتانول 35درجه
آب مقطر
5دقيقه
5دقيقه
5دقيقه
5دقيقه
5دقيقه
5دقيقه
5دقيقه
رنگآميزي و
آبگيري
هماتوکسيلين
شستشو با آب جاري
اتانول 35درجه
اتانول 50درجه
اتانول 70درجه
ائوزين
اتانول 90درجه
اتانول 96درجه
اتانول 100درجه
3دقيقه
2-1دقيقه
5دقيقه
5دقيقه
5دقيقه
7-5دقيقه
10ثانيه
10ثانيه
10ثانيه
شفاف کردن
تولوئن(1)
تولوئن(2)
5دقيقه
5دقيقه
چسبانيدن((Mounting
ابتدا روي لامل چسب کانادا بالزام زده، سپس لام رنگ شده از تولوئن خارج و بر روي آن لامل قرار مي گيرد. اين مقطع پس از خشك شدن براي مطالعه آماده است.
روش تشخيص رده هاي سلولي در توبول سميني فر
اسپرماتوگوني.سلولهاي مدوري هستند به قطر 12 ميكرون كه در محيط توبول سميني فر بر روي سطح داخلي غشاء پايه قرارگرفتهاند. سيتوپلاسم آنها روشن و هسته مدور آنها غالباً پركروماتين است.
اسپرماتوسيتدرنتيجه تقسيم ميتوزي سلولهاي اسپرماتوگوني،سلولهاي دختري به نام اسپرماتوسيت اول به وجود مي آيند. كه داخل تر از طبقه مادري قرار گرفته اند. اسپرماتوسيتهاي اوليه بزرگترين سلول جنسي موجود در توبول سميني فر بوده و سلولهايي گرد يا بيضي هستند. اين سلولها به طريقه ميوز تقسيم شده واسپرماتوسيتهاي دوم را ايجاد مي نمايند. دومين اسپرماتوسيت نسبت به اولين اسپرماتوسيت كوچكتر وداراي هسته اي روشن تر است.
اسپرماتيد.دومين اسپرماتوسيت بر اثر تقسيم خود سلول اسپرماتيد را به وجود مي آورد كه داخل تر ازمادرش قرار مي گيرد. اسپرماتيدها سلولهاي كاملاً كوچكتري مي باشند كه با هسته كوچك خود به صورت مجتمعي در نزديك فضاي توبول سميني فر ديده مي شوند.
اسپرم.اسپرماتيد پس از رشد و طي مراحل تمايز به اسپرم تبديل مي شود. اسپرم سلول دم داراي است كه دم آن به سمت فضاي توبول(luman) است و هسته دوكي تيره رنگ دارد.
سلول سرتولي .سلولي استوانه اي شکل است که از قاعده لوله اسپرم ساز شروع شده وخودش را تا ميانه لوله اسپرم ساز ميرساند.روي سطوح مختليف اين سلول شرايط توليد اسپرم فراهم مي شود،داراي هسته نسبتا تيره وهستک روشن ومشخص است.
آناليز هورموني و بيو

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید